哈密大枣中环磷酸腺苷的分离纯化工艺研究

2020-03-23于佳佳陈恺

食品研究与开发 2020年5期

于佳佳，陈恺

（1.新疆职业大学烹饪与餐饮管理学院，新疆乌鲁木齐830013；2.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质，是生命信息传递的“第二信使”[1]。在体内可以促进心肌细胞的存活，改善心肌缺氧的作用[2]。增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力；促进钙离子向心肌细胞内流动，增强磷酸化作用，促进兴奋-收缩偶联，提高心肌细胞收缩力，增加心输出量；同时还扩张外周血管，降低心脏射血阻抗，减轻心脏前后负荷，增加心排出量，改善心功能[3-4]。对心脏起到营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。红枣中 cAMP 含量高达 100 nmol/g～600 nmol/g[5]，是180 多种已测高等植物中含量最高的植物品种。新疆红枣栽培面积近50 万公顷，产量达300 万吨[6]。哈密地区日照时数之长，昼夜温差之大，日照率之高，为新疆乃至全国之最。目前，国外的cAMP 产品主要是从动物的内脏中提取，其成本较高，产量也较少[7-9]。本文以哈密大枣为研究材料，采用大孔树脂对哈密大枣提取液中cAMP 的分离纯化工艺进行研究，为哈密大枣以及其他枣品种的精深加工及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

哈密大枣：干枣，购于北园春干果市场。cAMP 标准品（纯度≥99%）：中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯）、磷酸二氢钾（优级醇）、无水乙醇（分析纯）、氨水（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、盐酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；离子交换树脂、D-101、HZ-802、AB-8 型大孔吸附树脂：艾美科健（中国）生物医药有限公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪：[包括SPD-20A 紫外检测器、LC-20AB 高压恒流泵、CTO-10AS 恒温柱温箱、Brava-BDS C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）]：日本岛津公司；SHB-111 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；KQ5200 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；AL204-IC 电子天平、FE20K-Plus pH 计：梅特勒-托利多仪器有限公司；JY2002 电子天平：上海良平仪器仪表有限公司；HH-S 恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；TDSA-WS 低速离心机：湘仪离心机仪器有限公司；烧瓶、三角瓶、玻璃棒。

1.3 方法

1.3.1 分离纯化工艺流程

提取液→大孔吸附树脂吸附→洗脱→真空冷冻干燥→哈密大枣cAMP 粗品

1.3.2 上样液的制备

将哈密大枣去核后，粉碎干燥过60 目筛至恒重，放置干燥器中备用，以1 ∶10（g/mL）的料液比加入蒸馏水，80 ℃水浴加热4 h，过滤后真空浓缩备用。

1.3.3 色谱条件

前期研究结果显示[10]，高效液相色谱测定条件为流动相为甲醇∶0.05 mol/L 磷酸二氢钾，体积比=10 ∶90，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，进样量：20 μL，检测波长：256 nm。

1.3.4 树脂预处理与活化

分别称取大孔吸附树脂HZ-802（非极性）、D101（非极性）、AB-8（弱极性）、离子交换型树脂各5 g 置于150 mL 三角瓶中，加入50 mL 95%乙醇溶液，进行摇床，条件为 20 ℃、180 r/min，摇床 24 h，使树脂充分活化。取出后滤去乙醇溶液，用4%氢氧化钠浸泡3 h 后用水冲洗至中性，再用2%盐酸浸泡3 h 后用水冲洗至中性后去离子超纯水保存待用[11-12]。

1.3.5 树脂的筛选

取上述活化后洗至中性的4 种树脂，滤去超纯水后各加入50 mL 哈密大枣提取液，进行摇床，条件为20 ℃、180 r/min，摇床 24 h，使其充分进行静态吸附。取上清液，过0.45 nm 滤膜，高效液相色谱测定cAMP 含量[13]，计算吸附率。根据测定结果分别计算4 种树脂的静态吸附率和解吸率。计算公式为：

式中：C0为提取液 cAMP 浓度，mg/mL；C1为吸附后溶液中cAMP 浓度，mg/mL；C2为解吸附后溶液中cAMP 浓度，mg/mL。

2 结果与分析

2.1 树脂筛选试验

2.1.1 静态吸附试验

精密量取预处理好的4 种大孔吸附树脂各20.00 g（湿重）置于三角瓶中，加入上样液200 mL，密封，于振荡器（20 ℃，180 r/min）中振荡，使其充分吸附，12 h 取上清液，检测溶液中cAMP 含量，计算其吸附率。试验结果见图1。

图1 不同树脂对哈密大枣cAMP 的静态吸附率Fig.1 Results of static adsorption of different macroporous resins to cAMP from Hami jujube

图1 结果表明，离子交换树脂对cAMP 的吸附效果较差，吸附率仅为7%左右，D101 型和AB-8 型树脂对cAMP 的吸附效果较好，吸附率分别为28.19%和29.95%，HZ-802 型树脂的吸附率在4 种树脂中最高，吸附率为38.64%。

2.1.2 解吸试验

通过吸附试验得知离子交换型树脂的吸附效果差，所以没有对离子交换树脂进行解吸试验。取充分吸附后的3 种树脂，过滤，分别取50 mL 20%乙醇和氨水作为洗脱剂，进行摇床解吸，条件为20 ℃、180 r/min，摇床24 h，使其充分进行解吸，取上清液，过0.45 μm滤膜，高效液相色谱测cAMP 含量，计算解吸率。试验结果见图2。

图2 不同树脂对哈密大枣cAMP 的解吸率Fig.2 Results of static desorption of cAMP from Hami jujube from different macroporous resins

图2 结果表明，通过20%乙醇洗脱剂进行解吸时，HZ-802 型树脂的解吸效果在3 种树脂中最差，解吸率为71.95%。D101 型树脂的解吸率最高，解吸率为85.15%。AB-8 型树脂的解吸率与D101 型相差不大，解吸率为84.55%。3 种树脂使用20%乙醇洗脱剂的洗脱效果均高于氨水洗脱剂，所以选择20%乙醇作为洗脱剂。结合吸附率试验，HZ-802 树脂的吸附效果较好，故选用HZ-802 型树脂吸附，20%乙醇溶液作为洗脱剂进行后续试验。

2.2 HZ-802型树脂对哈密大枣cAMP动态吸附试验

2.2.1 泄露曲线的研究

泄漏曲线的测定可以确定动态吸附时的上样体积。取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，选择上样液cAMP 浓度15 μg/mL，pH 5，流速1.0 mL/min，进行分管收集，每管收集20 mL，过0.45 nm 滤膜，进高效液相色谱测定cAMP 的浓度。试验结果见图3。

图3 HZ-802 型树脂对哈密大枣cAMP 的吸附泄露曲线Fig.3 Leak curve of HZ-802 resin adsorbing cAMP from Hami jujub

图3 结果表明，当收集到第10 管时，可以测得cAMP 含量为 7.94 μg/mL，且后续收集管 cAMP 含量呈增长趋势，所以确定此点为泄漏点，最大上样体积确定为220 mL。

2.2.2 流速的选择

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，选择上样液的流速分别为1、1.5、2、2.5、3 mL/min，上样液 cAMP 浓度 15 μg/mL，pH 5，上样体积为220 mL 进行动态吸附，收集流出液过0.45 μm滤膜，进高效液相色谱测定cAMP 的浓度，计算吸附率。结果见图4。

图4 上样液流速对树脂吸附率的影响Fig.4 Effects of flow rate of sample solution on adsorption rate of HZ-802 resin

图4 结果表明，在低流速时，HZ-802 型树脂对cAMP 的吸附效果较好，可能是由于上样液在柱中时间更长，有利于树脂的充分吸附，流速越慢吸附所需要的时间也越长。流速为1.0 mL/min 时树脂的吸附效果最好，吸附率为97.94%。流速在1.5 mL/min 时的吸附率为96.27%，流速在2.0 mL/min 的吸附率为96.18%，流速在 2.5 mL/min 时，HZ-802 型树脂对 cAMP 的吸附率有明显的下降，吸附率降为92.83 %。流速在3.0 mL/min 时吸附率为89.42%。综合时间、吸附效率考虑，选择上样液流速为2.0 mL/min。

2.2.3 上样液浓度的选择

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，调节上样液cAMP 浓度分别5、10、15、20、25、30、35、40 μg/mL，上样液 pH 5，上样液流速2.0 mL/min，上样体积为220 mL 进行动态吸附，收集流出液过0.45 nm 滤膜，进高效液相色谱测定cAMP的浓度，计算吸附率。结果见图5。

图5 上样液浓度对树脂吸附率的影响Fig.5 Effects of cAMP concentration of sample solution on adsorption rate of HZ-802 resin

图5 结果表明，低浓度的上样液更容易让HZ-802 型树脂对cAMP 进行吸附，随着上样液浓度的升高，树脂对cAMP 的吸附效果逐渐降低。上样液cAMP浓度在5 μg/mL 时吸附率最大，吸附率为97.77%。上样液浓度在 10、15、20、25 μg/mL4 个浓度吸附率较高且相差不大，吸附率分别为96.77%、96.18%、95.82%、95.85%。当 cAMP 浓度高于 25 μg/mL 时，树脂对cAMP的吸附率则随着上样液中cAMP 浓度的升高而有明显降低，浓度在 30、35、40 μg/mL 时吸附率为 92.69%、91.35%、90.65%。所以选择上样液浓度为25 μg/mL。

2.2.4 上样pH 值选择

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，选择大枣提取液的上样pH 值分别为3、4、5、6、7、8，上样液 cAMP 浓度 25 μg/mL，上样液流速2.0 mL/min，上样体积为220 mL 进行动态吸附，收集流出液过0.45 nm 滤膜，进高效液相色谱测定cAMP的浓度，计算吸附率。结果见图6。

图6 上样液pH 值对树脂吸附率的影响Fig.6 Effects of sample solution pH value on adsorption rate of HZ-802 resin

图6 结果表明，pH 值对树脂吸附cAMP 有很大影响，上样pH 3 时不利于树脂对cAMP 的吸附，吸附率最低为81.18%。随着pH 值升高吸附率略有提升，在pH 4、5、6 时的吸附率为 94.98%，95.13%、95.69%。当pH 值继续升高，树脂对cAMP 的吸附率则随着pH 值升高而略有降低，pH 7、8 的吸附率分别为94.32%和93.70%。综上所述，上样pH 值选择为pH 6。通过单因素试验，确定HZ-802 型树脂的吸附条件为上样流速2.0 mL/min，上样浓度 25 μg/mL，上样 pH 6。

2.2.5 正交试验

通过单因素试验确定的条件，进行正交试验。对上样液流速、浓度、pH 值3 个因素，每个因素3 个水平，采用L（933）正交表设计正交试验，见表1。

表1 L9（33）正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of L9（33）orthogonal test

表2 正交试验结果及极差分析Table 2 Results of L9（33）orthogonal experimental and range analysis

正交试验极差分析得到结果，HZ-802 型树脂吸附cAMP 的最佳因素为上样液流速为2.0 mL/min，上样液浓度20 μg/mL，pH 5，吸附率为98.50%。对此结果进行验证试验，得到结果见表3。

表3 验证试验Table 3 Verification test

验证试验结果证明，通过3 次水平试验验证了正交试验得到的条件为HZ-802 型树脂吸附cAMP 的最佳条件，即上样液流速2.0 mL/min，上样液浓度20 μg/mL，pH 5，吸附率为98.50%。

2.3 HZ-802型树脂对哈密大枣cAMP动态解吸试验

2.3.1 洗脱曲线

洗脱曲线的测定可以确定动态解析时的洗脱液体积。取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，选择大枣提取液的上样液流速2.0 mL/min、浓度 20 μg/mL、pH 5，上样体积 220 mL 进行吸附。充分吸附后用洗脱液20%乙醇溶液，洗脱液流速1.0 mL/min 进行洗脱，分管收集，每管收集20 mL，过0.45 μm 滤膜，高效液相色谱测定cAMP 的浓度。试验结果见图7。

图7 洗脱曲线Fig.7 Elution curve of cAMP

图7 结果表明，当收集至第3 管洗脱液时，可以测得cAMP 的含量最高，当收集至第5 管洗脱液时，洗脱液中已经未测到cAMP 含量，所以确定洗脱液用量体积定为120 mL。

2.3.2 洗脱液流速的选择

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，选择大枣提取液的上样液流速2.0 mL/min、浓度 20 μg/mL、pH 5，上样体积 220 mL进行吸附。充分吸附后用洗脱液20%乙醇溶液，以洗脱液流速 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min，洗脱液体积 120 mL进行洗脱，收集洗脱液过0.45 nm 滤膜，进高效液相色谱测定cAMP 含量，计算解吸率。试验结果见图8。

图8 洗脱流速对树脂解吸率的影响Fig.8 Effects of flow rate of eluent on desorption rate of cAMP from HZ-802 resin

图8 结果表明，洗脱液的流速过高或者过低对解吸都有很大的影响。洗脱液流速1.0 mL/min 时解吸效果较差，解吸率为88.16%。流速过高时可能由于洗脱液下降过快，与树脂没能完全接触，导致没有完全洗脱，所以解吸率低。当洗脱液流速为5.0 mL/min 时，解吸率为88.45 %。洗脱液流速控制在2.0 mL/min 和3.0 mL/min 时解吸效果较好，解吸率为92.59 %和93.25%。故选择洗脱液流速为3.0 mL/min。

2.3.3 洗脱液浓度的选择

取充分活化后洗至中性的HZ-802 型树脂25.00 g，填装入层析柱，选择大枣提取液的上样液流速2.0 mL/min，浓度 20 μg/mL，pH 5，上样体积 220 mL 进行吸附。充分吸附后用洗脱液浓度为10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶液，洗脱液流速3.0 mL/min，洗脱液体积120 mL 进行洗脱，收集洗脱液过0.45 nm 滤膜，进高效液相色谱测定cAMP 含量，计算解吸率。试验结果见图9。

图9 乙醇浓度对树脂解吸率的影响Fig.9 Effects of ethanol concentration as eluent on desorption rate of cAMP from HZ-802 resin

图9 结果表明，乙醇浓度的大小对于cAMP 的解析效果有明显影响，随着乙醇浓度的提高分离效果也随之提高，以40%乙醇洗脱效果最佳。乙醇能与水以任意比互溶，乙醇溶液中醇浓度越高，极性越弱，越有利于cAMP 这种弱极性物质的洗脱。当洗脱液为10%乙醇时的解吸效果较差，解吸率为79.01%。而洗脱液为50 %乙醇时的解吸效果也相对较差，解吸率为87.78%。当乙醇浓度为20%、30%、40%时，解吸率随着浓度的升高而略微升高，分别为92.59%、93.47%、97.32%。综上所述，洗脱液为40%乙醇溶液对cAMP 的解吸效果最佳，故选择洗脱液浓度为40%乙醇溶液[14]。

2.4 粗提物的测定

根据上样液浓度与洗脱液浓度计算，得到HZ-802型树脂对cAMP 的纯化倍数为1.76 倍。取大孔吸附树脂纯化后的粗提液，旋转蒸发浓缩后，在-70 ℃冰箱内冷冻过夜，于冷冻干燥机进行干燥，干燥参数为：-20 ℃、12 h→ 0 ℃、6 h→10 ℃、3 h→30 ℃、4 h，得到粗提物粉末。精密称取1 g 粗提物粉末，定容至100 mL容量瓶，过0.45 μm 滤膜，高效液相色谱测定cAMP 含量，计算的粗提物中cAMP 含量为0.10%，试验结果与尤妍等哈密大枣中粗提液纯化干燥后cAMP 含量保持一致[15-17]。