副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体的重组表达及抗体交叉反应

梁夏夏，袁倩云，刘 蕾，郭珊珊，王文彬,

（1.江苏海洋大学食品科学与工程学院，江苏连云港 222005；2.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室，江苏连云港 222005；3.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏连云港 222005）

食源性疾病是世界上日益严重的公共卫生问题，可导致严重的经济损失[1]。副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于全球近岸海水、海底沉积物和鱼类、贝类等海洋生物中，是引起我国沿海地区及大城市食物中毒的首要病原菌[2]。食用污染副溶血性弧菌的鱼、虾、贝等海鲜产品可以引发食物中毒，临床表现为发热、呕吐、头痛、腹泻等症状，严重的可引起败血症[3−6]。副溶血性弧菌也是海水养殖中细菌性病害的常见病原，给水产养殖业造成了巨大的经济损失[7]。因此，研究副溶血性弧菌诊断抗原对食品安全和水产养殖领域具有重要意义。

细菌外膜蛋白主要为受体蛋白和转运蛋白，主要作用是协助细菌与外环境联系以获取所需的营养物质。外膜蛋白具有组成型膜蛋白、脂蛋白、LPXTG-样末端蛋白、非共价偶联蛋白等类型，典型结构为β-桶状结构，外膜蛋白除了有常规的渗透特性、维持细胞膜膜稳定性等功能外，与弧菌致病性等诸多方面均具有密切关系。部分外膜蛋白具有黏附作用，可促进致病菌的侵袭和体内增殖[8−10]；外膜蛋白还具有良好的免疫原性，其不仅可以刺激机体的体液免疫，对细胞免疫也有刺激作用[11]。部分外膜蛋白具有细菌表面的暴露表位和在不同的血清型之间的保守性[12−13]，是潜在的诊断抗原。目前弧菌保守性外膜蛋白研究较多，副溶血性弧菌特异性外膜蛋白报道较少。其它已研究的弧菌外膜蛋白有OmpK、OmpU、OmpW、OmpA 等[14−17]，弧菌OmpK 重组蛋白抗体对不同副溶血性弧菌弧菌有一定效价，OmpU 重组蛋白血清对不同弧菌有较好的免疫交叉反应力，OmpW 重组蛋白制备的单抗对多种弧菌有交叉反应。

铁是绝大多数细菌生存所需要的元素，而宿主细胞体内的铁多以亚铁红素、铁结合蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白等形式存在[18]，细菌难以直接获取。副溶血性弧菌拥有多种摄铁系统，在缺铁环境下，其本身产生一种载铁体称为弧菌铁蛋白vibrioferrin 以促进铁的获取[19]。弧菌铁蛋白与环境中Fe3+络合后，被运送到与之特异性结合的表面受体蛋白，即弧菌铁蛋白受体；该蛋白分子量78.7 kDa，由pvuA基因表达，其转运过程需要TonB 系统的帮助[20]。目前对于弧菌铁蛋白受体的免疫原性研究未见报道。

前期研究从副溶血性蛋白质数据库出发，采用生物信息学预测所有外膜蛋白，通过蛋白序列BLAST 筛选出包括VP1008、弧菌铁蛋白受体在内的17 种副溶血性弧菌差异性外膜蛋白，这些蛋白在副溶血性弧菌内保守性均大于92%，VP1008 与弧菌属外的细菌相似性<27%，弧菌铁蛋白受体与弧菌属外细菌的同源性较低[21]。本研究旨在重组表达并分析副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体新型抗原小鼠免疫血清的效价水平、特异性和交叉性，为副溶血性弧菌免疫分析方法和检测试剂盒的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

限制性内切酶XhoⅠ（酶活：10000 U/mL）、NcoⅠ（酶活：10000 U/mL）、DNA Marker、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、异丙基硫代-β-D 半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、双色预染蛋白 Marker、SDSPAGE 凝胶电泳所需试剂 生工生物工程（上海）股份有限公司；6～8 周龄的BALB/c 小鼠（许可证号：SCXK（苏）2017-0007） 扬州大学兽医学院；弗氏完全佐剂、不完全佐剂和牛血清蛋白（BSA）Sigma 公司；羊抗鼠二抗 Jackson Immuno Research公司；沉淀型TMB 底物缓冲液 广州捷倍斯生物科技有限公司；蛋白酶K（酶活：40 U/mg） Solarbio 公司；原核表达载体pET-28a（+）、大肠杆菌DH5α、和BL21（DE3）为本实验室保存；本研究所用的菌株见表1；其他化学试剂 均购自上海国药化学试剂有限公司。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in this study

Minin-PROTEAN 小型蛋白垂直凝胶电泳系统上海坤科仪器设备有限公司；DGGE 凝胶电泳设备 美国伯乐公司；透析袋（截留相对分子质量14000 Da）上海桥星贸易有限公司；96 孔酶标板 无锡国盛生物工程有限公司；Infinite F50 酶标仪Tecan 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 副溶血性弧菌VP1008 和弧菌铁蛋白受体结构模拟 根据NCBI 中VP1008（GenBank：GI：28897782）和弧菌铁蛋白受体（GenBank：GI：28901511）的基因序列，提交TrRosetta[22]在线服务器进行模拟，Tm 值>0.5 表明模拟质量较高。蛋白二级结构α-螺旋采用红色表示，无规则卷曲采用绿色表示，β-折叠采用黄色表示。

1.2.2 副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体基因克隆 外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体的目的基因序列插入限制性酶切位点XhoⅠ、NcoⅠ后，使用软件primer premier 5.0 设计引物，如表2。用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB）提取基因组：将VP CICC21617 培养至对数期，3 mL VP CICC21617 菌液8000 r/min 离心5 min 后向沉淀中加入TE 缓冲液和蛋白酶K 混匀，37 ℃反应1 h，加入NaCl 溶液、CTAB/NaCl 溶液混匀，65 ℃反应15 min，加入体积比为25:24:1的酚、氯仿、异戊醇的混合物除去蛋白层物质，加入约是上清溶液0.6 倍体积的异丙醇，冰上静置1 h，12000 r/min 离心15 min，无菌风吹干多余水分，无菌超纯水充分溶解。基因组DNA 作为模板，PCR 反应程序均为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，反应30 个循环，72 ℃10 min。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后切胶回收[23]。

表2 引物序列Table 2 Primers sequence

1.2.3 重组质粒的构建及阳性克隆筛选 外膜蛋白VP1008、弧菌铁蛋白受体的目的基因VP1008 和pvuA，以及pET-28a（+）质粒经双酶切后，通过T4 连接酶连接得到重组质粒pET-28a（+）-VP1008 和pET-28a（+）-pvuA。将重组质粒转入E.coliDH5α感受态，在平板上挑取6 个单菌落做PCR 验证，抽提重组质粒并由生工生物测序，将测序验证后的重组质粒转化到表达宿主E.coliBL21（DE3），制作阳性转化子甘油菌，保藏于−80 ℃[24]。

1.2.4 重组蛋白VP1008、弧菌铁蛋白受体的表达与纯化 将阳性转化子的甘油菌在含100 μg/mL 卡那霉素的LB 固体培养上，37 ℃培养箱培养14 h 后，用接种环挑取单菌落至50 mL 含100 μg/mL 卡那霉素的LB 液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养14 h。阳性转化子种子液按1%比例接种于50 mL 含100 μg/mL 卡那霉素的LB 液体培养基中，37 ℃摇床振荡培养至对数期（OD600nm0.6～0.8），向菌液中加入IPTG 至终浓度为1.0 mmol/L，37 ℃、180 r/min摇床振荡过夜。5000 r/min 离心20 min 后收集菌体，用无菌水重悬后，冰浴超声破碎（400 W，30 min）后，8000 r/min 离心20 min 并收集上清和沉淀，用SDS-PAGE 检测重组蛋白的表达情况。将蛋白包涵体用8 M 尿素变性后进行镍柱亲和层析纯化。配制1 L浓度为6 mol/L 尿素溶液作为透析液，将纯化蛋白转移至透析袋内，再将装有纯化蛋白的透析袋放入盛有提前配制好的透析液烧杯中，烧杯中放入转子，将烧杯放在磁力搅拌器上进行磁力搅拌，4 ℃ 环境中透析12 h 后，将透析液浓度降低至3 mol/L 尿素溶液，按照同样的方法进行透析，之后透析液浓度分别为：2、1、0.5 mol/L 尿素溶液进行梯度透析复性实验，透析实验结束后用Millipore 超滤管（截断分子量：10 kDa）浓缩样品，Bradford 法定量后冻存于−20 ℃[25]。

1.2.5 动物免疫鼠多抗制备 8 周龄的雄性BALB/c小鼠适应环境一周后，进行免疫实验。首次免疫将重组蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体分别与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，采用背部多点注射免疫，免疫剂量为80 μg/只，两种蛋白分别免疫10 只小鼠，空白组小鼠5 只，共计25 只小鼠。加强免疫每隔20 d 免疫一次，第二次免疫剂量为80 μg 蛋白/只，使用弗氏不完全佐剂乳化，免疫方法与首次免疫相同。第三次免疫剂量为40 μg 蛋白/只，乳化和免疫方法同第二次免疫。空白组小鼠免疫PBS，乳化和免疫方式同上。三免过后一周，对小鼠进行尾部采血，采血结束后室温静置30 min，离心机6000 r/min 离心15 min，上清即为抗血清，−20 ℃保存备用[26]。

1.2.6 间接ELISA 法和Western blot 法测定血清效价及交叉反应 将表1 中细菌用LB 培养基液体（弧菌培养添加3% NaCl）培养18 h 后煮沸灭活15 min，将菌液和重组蛋白分别用碳酸盐缓冲液稀释到3×107CFU/mL、0.5 μg/mL 后包被96 孔酶标板，加入小鼠免疫血清（500 倍开始，3 倍梯度稀释）37 ℃反应30 min，洗板后加入HRP 标记的羊抗鼠IgG（0.12 μg/mL）37 ℃反应30 min，洗板后加入显色液显色15 min，用2 mol/L H2SO4终止反应后用酶标仪测定OD450nm吸光值。用抗体稀释液做阴性对照，当血清某一稀释度下OD450nm与阴性对照OD450nm之比（P/N）≥2.1 时，则该稀释度就是血清效价。用Western blot 方法检测抗血清特异性，将表1中细菌用LB 液体培养基（弧菌培养添加3% NaCl）培养18 h，5000 r/min 离心20 min，超声破碎的细菌全菌蛋白经SDS-PAGE 胶分离后转膜至聚偏二氯乙烯膜（PVDF）上，37 ℃封闭2 h；加入稀释4000 倍的小鼠抗血清后室温反应1 h，用缓冲液洗涤3 遍后加入稀释0.2 μg/mL的羊抗鼠二抗室温避光反应1 h，再用缓冲液洗涤5 遍；随后加入TMB 沉淀型底物显色5～10 min，出现清晰条带后水洗终止反应，拍照并观察[27]。

1.3 数据处理

所有测定血清效价实验，每组实验重复三次，测得的OD450nm吸光值结果以平均值和标准偏差表示，数据统计使用Microsoft Excel 2016 软件进行处理。血清效价以柱状图的形式表示，使用Origin 2019 软件进行绘制。

2 结果与分析

2.1 外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体的结构模拟

目前关于VP1008 蛋白和弧菌铁蛋白受体蛋白的结构相关研究较少，使用TrRosetta 模拟的蛋白结构图表明VP1008 和弧菌铁蛋白受体模拟结构的Tm 值分别为0.734 和0.789，均大于0.5，说明蛋白结构模拟质量较好。如图1 所示，两种蛋白均具有典型的β-桶状结构，进一步说明VP1008 蛋白和弧菌铁蛋白受体蛋白是副溶血性弧菌外膜蛋白。

图1 VP1008 和弧菌铁蛋白受体蛋白结构Fig.1 Protein structure of Omp VP1008 and ferric vibrioferrin receptor

2.2 目的基因的PCR 扩增与阳性重组质粒的筛选

外膜蛋白VP1008 基因和弧菌铁蛋白受体pvuA的PCR 扩增产物（图2）分别出现在1000、2000 bp 左右，与理论分子量1080 bp（VP1008）、2139 bp（pvuA）相近。将转化后的重组质粒进行PCR 验证（图3）表明，pET-28a（+）-VP1008的1、3、4、5、6 号单菌落扩增出VP1008 基因大小相近的条带，pET-28a（+）-pvuA的1、3、4、5 号单菌落可扩增出pvuA基因大小相近的条带。重组质粒双向测通序列，得到的测序结果与目的核苷酸序列对比结果（图4），VP1008和pvuA测序基因序列（图4a,b）分别与NCBI 数据库中各自对应的目的核苷酸序列用软件MEGA 进行序列对比，可以看到两条测序核苷酸序列均有突变，但送检质粒核酸序列与NCBI 数据库中目的基因核酸序列相似性均在98.5%以上，说明重组质粒构建成功。

图2 VP1008（a）和弧菌铁蛋白受体pvuA（b）目的基因PCR 产物电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification product of VP1008（a）and pvuA（b）

图4 VP1008 测序基因序列（a）和弧菌铁蛋白受体pvuA 测序基因序列（b）Fig.4 Detection of gene sequence of VP1008（a）and pvuA（b）

2.3 重组蛋白的表达与纯化

诱导结果如图5a 所示，泳道1 和泳道2 分别对应加诱导剂的空质粒pET-28a 上清和沉淀，泳道3 和泳道4 分别对应加诱导剂的重组质粒pET-28a（+）-pvuA上清和沉淀，泳道5 和泳道6 分别对应加诱导剂的重组质粒pET-28a（+）-VP1008 上清和沉淀。图中对照组加诱导剂的空质粒pET-28a 上清（泳道1）和沉淀（泳道2）中均未见两种蛋白目的条带，说明空质粒未插入目的基因不表达目的蛋白；弧菌铁蛋白受体目的条带在重组质粒pET-28a（+）-pvuA上清（泳道3）中未有出现，而在沉淀（泳道4）中出现，与蛋白弧菌铁蛋白受体理论分子量78.752 kDa大小相近；pET-28a（+）-VP1008 上清（泳道5）中未见蛋白VP1008 目的条带，pET-28a（+）-VP1008 沉淀（泳道6）出现目的条带，与VP1008 理论分子量39.325 kDa 大小相近。两种重组质粒诱导的上清中未出现目的条带，沉淀中均出现目的条带说明两种蛋白均以包涵体形式表达。优化IPTG 浓度和诱导温度后也仍以包涵体形式表达。随后用高浓度尿素分别溶解两种包涵体后采用镍柱进行亲和层析纯化（图5b,c），图5b 是纯化后的重组弧菌铁蛋白受体蛋白，图5c 是纯化后的重组VP1008 蛋白。将洗脱下来的蛋白进行尿素梯度透析复性，当尿素浓度降低至0.5 mol/L 后蛋白析出为不可溶状态，最终均采用包涵体蛋白进行后续免疫。

图5 重组蛋白诱导表达和蛋白纯化结果Fig.5 SDS-PAGE of the recombinant proteins after IPTG induction and purification

2.4 重组蛋白的免疫血清效价和交叉反应

经间接ELISA 检测外膜蛋白VP1008、弧菌铁蛋白受体、PBS 免疫的小鼠血清对重组蛋白和菌体的效价。图6 结果显示，蛋白VP1008 免疫的小鼠血清与副溶血性弧菌CICC 21617、CICC 21618、CICC 21528、CGMCC 1.1614、CGMCC 1.1616 反应效价为13.5 K，与副溶血弧菌CICC 21619、CICC 10552反应效价为4.5 K，与鳗弧菌、哈维氏弧菌、解藻酸弧菌、杀岩龙虾弧菌、魔鬼弧菌、坎氏弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌、费氏另类弧菌、霍氏格力蒙特弧菌无交叉反应，与大肠杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌的交叉反应效价分别为81.0、27.0、3.0 K，与免疫的VP1008 蛋白反应的效价最高达到1045.5 K。对照组小鼠对测试菌的效价均<1 K。全菌蛋白的免疫印迹结果显示，蛋白VP1008 免疫的小鼠血清与上述7 株副溶血性弧菌的主要反应条带在35 kDa 左右，与VP1008 理论分子量较为接近，该印迹条带在其它弧菌中未出现或条带较弱。此外，印迹显示血清与大肠杆菌、嗜水气单胞菌、无丙二酸柠檬酸杆菌的反应条带也主要出现在25～30 kDa 左右。这些蛋白与目的蛋白具有同源性反应，或者为大肠杆菌残留蛋白，引起了与肠杆菌的交叉反应。这说明镍柱洗脱过程中，应该收集纯度更高的穿透液以减少残留蛋白对血清交叉反应评价的影响，并通过后续细胞融合和抗体筛选中采用不同菌体包板排除这些交叉反应。

图6 VP1008 免疫原血清效价和免疫印迹Fig.6 The antibody titer and immunoblotting results of Omp VP1008

如图7 所示，弧菌铁蛋白受体免疫的小鼠血清与本实验检测的副溶血性弧菌CICC 21618、CICC 21619、CICC 10552 反应效价为13.5 K，与副溶血弧菌 CICC 21617、CICC 21528、CGMCC 1.1614、CGMCC 1.1616 反应效价为4.5 K，与鳗弧菌、哈维氏弧菌、解藻酸弧菌、杀岩龙虾弧菌、魔鬼弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌、费氏另类弧菌、霍氏格力蒙特弧菌无交叉反应，与大肠杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌的交叉反应效价分别为27.0、27.0、1.0 K，仅与测试弧菌中的坎氏弧菌有轻微交叉反应（1.0 K），与弧菌铁蛋白受体蛋白反应的效价达到29524.5 K。免疫印迹结果显示，蛋白弧菌铁蛋白受体血清与副溶血性弧菌在25 kDa 和70 kDa 附近出现印迹条带，其中在70 kDa 处发生的反应条带与弧菌铁蛋白受体的理论分子量较为接近，但70 kDa 左右的反应条带微弱，说明弧菌铁蛋白受体的免疫原性较弱或重组蛋白与天然蛋白结构存在差异。此外，免疫印迹实验结果中出现的非特异性反应条带与本实验所用的抗体为小鼠多抗血清也有一定关系，一般单克隆抗体识别单一表位，具有更好的特异性。

图7 弧菌铁蛋白受体免疫原血清效价和免疫印迹Fig.7 The antibody titer and immunoblotting results of ferric vibrioferrin receptor

3 讨论与结论

近年来副溶血性弧菌感染引起的食物中毒案例呈逐年上升趋势，已经成为我国食源性疾病的首要致病菌。在免疫分析和疫苗领域，细菌外膜蛋白受到越来越多的学者关注，已有研究表明外膜蛋白通常具有较强的免疫原性，可以作为免疫检测抗原和特异性检测抗体[28−29]，但目前副溶血性弧菌特异性较好的表面外膜蛋白和抗体仍鲜有报道。因此发掘新型副溶血性弧菌特异性抗原对于开发快速检测副溶血性弧菌的诊断抗体是十分重要的[30−31]。

本文利用大肠杆菌原核表达系统成功构建了两种新型副溶血性弧菌外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体的重组质粒，并经诱导纯化后制备出重组蛋白。两种重组外膜蛋白经培养条件优化后最终均以包涵体形式表达，这与细菌外膜蛋白结构、蛋白大小以及大肠杆菌表达系统特点有关。细菌外膜蛋白的β-折叠区域具有较强的疏水性，常规大肠杆菌表达系统的折叠速度较快，部分外膜蛋白未能正确折叠形成包涵体，尤其是分子量较大的蛋白。外膜蛋白VP1008 免疫血清对副溶血性弧菌的整体效价比弧菌铁蛋白受体免疫血清高，但两种重组蛋白的鼠多抗对副溶血性弧菌的效价均不高（4.5～13.5 K），一方面可能因为重组蛋白以包涵体形式表达，结构上存在一定差异。另一方面可能是副溶血性弧菌表面的荚膜（K 抗原）等多糖抗原影响了蛋白的暴露。荚膜是副溶血性弧菌的主要抗原，已有报道荚膜的长度在100～500 nm 之间[32]，可以保护细胞逃避免疫系统和抗体（10 nm 左右）的识别[33]。后续研究将通过荚膜突变菌株来进一步验证荚膜对免疫血清识别的影响。血清与其它细菌特异性方面，本研究测试了与多株副溶血性弧菌、序列同源性较高的部分弧菌及海洋细菌等的交叉反应，VP1008的免疫血清与对不同来源的副溶血性弧菌具有良好的识别性，与其它测试弧菌均无交叉反应，弧菌铁蛋白受体免疫血清也仅与坎氏弧菌有轻微交叉，这与序列同源性分析结果有一定差异，可能与蛋白的保守序列位于细胞膜内或被弧菌荚膜等表层多糖掩盖有关。以往副溶血性弧菌外膜蛋白的免疫原性研究发现OmpK、OmpU、OmpW 等弧菌保守性外膜蛋白的免疫血清具有弧菌属内交叉反应[14−16]；最近，王亚磊等[34]的研究发现OmpA 重组蛋白免疫血清可与不同血清型的副溶血性弧菌发生特异性反应,而与其他非副溶血性弧菌无交叉反应,提示OmpA 可能是副溶血性弧菌的特异性抗原。

免疫印迹中抗弧菌铁蛋白受体蛋白血清与副溶血弧菌全菌蛋白发生反应条带应该出现在78 kDa（理论分子量）处，图上显示反应条带出现在70 kDa处，抗VP1008 血清与副溶血弧菌以及重组蛋白VP1008 反应条带应出现在40 kDa 处，免疫印迹显示反应条带出现在35 kDa 处，与理论有所偏差。王亚磊等[34]的研究成功表达、纯化了可溶性的副溶血性弧菌外膜蛋白OmpA，其蛋白分子理论分子量为33.8 kDa，免疫印迹产生的特异性条带表观分子量约36 kDa，说明这种实际误差是客观存在的。

本研究首次构建了副溶血性弧菌新型差异性外膜蛋白VP1008 和弧菌铁蛋白受体的PET-28a 重组质粒，诱导纯化后获得了2 种重组蛋白包涵体。小鼠免疫和血清评价表明，重组外膜蛋白VP1008的鼠多抗对7 株副溶血性弧菌菌体均有一定效价，对其它测试的10 种弧菌的特异性也较好，说明外膜蛋白VP1008 具有较好的序列特异性及与菌体的反应性，可用于进一步制备副溶血性弧菌检测抗体。同时，两种重组蛋白免疫血清与副溶血性弧菌菌体的效价均未达到27 K，这可能与副溶血性弧菌荚膜等多糖抗原的位阻作用等有关，具体有待进一步研究证实。本研究为建立新型副溶血性弧菌免疫检测方法提供了理论和数据基础。