加热方式对混合鱼糜凝胶特性的影响

张一鸣，李思仪，沈晓溪，石晨晖，尚宏丽

（锦州医科大学食品科学与工程学院，辽宁锦州 121001）

加热处理是鱼糜制品重要的加工步骤，鱼糜加热成鱼糜凝胶的过程中，蛋白质在凝胶形成过程中分为两个阶段，即为凝胶化阶段和凝胶劣化阶段。低于50 ℃是鱼糜凝胶化阶段，又称为低温凝胶化，肌原纤维蛋白在盐分的作用下溶出，形成松散的网状结构，蛋白从溶胶变为凝胶；50～70 ℃时是凝胶劣化的阶段，鱼糜中蛋白质可以被内源性组织蛋白酶所降解，迫使鱼糜中蛋白质网络断裂，从而造成凝胶劣化[1−3]。因此，在鱼糜生产过程中要尽量避开这个温度段，降低凝胶劣化的程度，当温度达到85 ℃以上后，进入鱼糕化阶段，凝胶变成有序、非透明状，鱼糜凝胶强度明显增大。因此加热的方式可直接影响鱼糜凝胶的形成[4]。传统的水浴加热、高温蒸汽加热、微波加热、超高压熟制等都是应用范围较广的鱼糜加热方式[5]。其中，微波加热因具有加热时间短、加热速度快的特点，可以快速经过鱼糜凝胶劣化区间，能够有效改善鱼糜的凝胶特性，但同时因为快速经过鱼糜凝胶的阶段，会影响肌原纤维蛋白的展开以及后续的交联[6]。所以在原有基础上采用将水浴与微波相结合的水浴微波联用法比单独的微波加热法制备的混合鱼糜制品既可以在40 ℃低温凝胶状态下保持稳定又可以快速经过凝胶劣化阶段。目前，在鱼糜的加热选择中，大多还是选择水浴二段加热法，也有研究者研究出不同的加热方式，用来弥补水浴二段加热法的不足，但是不同研究人员认为的好坏加热方式也不一样[7−8]，所以在此研究基础上将不同加热方式进行比较。

本文选择外源添加马铃薯淀粉、谷氨酰胺转氨酶（TGase）以及蛋清蛋白的鲢鱼与鳕鱼的混合鱼糜为原料，研究5 种不同加热方式（水浴二段加热、微波加热、水浴微波联用、蒸汽加热、高压熟制）对混合鱼糜凝胶特性的影响，结合质构仪、SDS-PAGE 凝胶电泳和扫描电镜技术分析，选取适合的加热方式为产出品质优质的混合鱼糜制品提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷冻鲢鱼糜、冷冻鳕鱼糜 湖北洪湖市井力水产食品有限公司；聚乙烯材料肠衣 鹏翼肠衣工厂店；谷氨酰胺转氨酶（酶活100 IU/g） 江苏一鸣生物股份有限公司；食盐、马铃薯淀粉 市售；蛋清蛋白粉 苏州欧福蛋业股份有限公司；tris 盐 天津大茂试剂公司；2.5%戊二醛 山东利尔康医疗器械股份有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇 天津化学试剂厂；考马斯亮蓝R-250、甘氨酸、溴酚蓝、SDS（十二烷基硫酸钠） 中国医药集团上海化学试剂公司；冰乙酸、甲醇（均为AR） 沈阳试剂厂；实验室自制重蒸水和三蒸水。

TA-XT Plus 型质构仪 英国Stable Micro System公司；SS300 型三足离心机 上海浦东天本离心机械有限公司；CT15RT 型台式高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司；SC-80C 型全自动色差计 北京康光仪器有限公司；HH 型数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；85-2B 双数显恒温磁力搅拌器 济南欧莱博技术有限公司；BYNJ1-3 实验室微波炉 长沙巴跃仪器有限公司；164-5050电泳仪 美国伯乐Bio-Rad；KYKY-EM8000F 型扫描电镜 北京中科科仪股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合鱼糜的制备 将鲢鱼与鳕鱼鱼糜在室温下解冻，鲢鱼鱼糜与鳕鱼鱼糜按照5:1的比例复合，再添加0.4%谷氨酰胺转氨酶，16%马铃薯淀粉以及4%蛋清蛋白粉调节至水分含量为70%，加入2.5%NaCl 擂溃成型后将其灌入准备好的肠衣中[9]。

1.2.2 混合鱼糜凝胶的制备 将灌好的混合鱼糜通过不同加热方式进行加热，然后迅速放入凉水中使其凝胶化后放入4 ℃冰箱冷藏保存，待测。

1.2.3 混合鱼糜五种不同加热方式 根据目前研究出的加热方式整理如表1。

表1 不同加热方式的加热时间Table 1 Heating time of different heating modes

1.2.4 凝胶强度的测定 将混合鱼糜凝胶切成高为20 mm的圆柱体，选择用5 mm的通用柱形探头的质构仪对样品进行两次压缩，测前速度为2 mm/s，测试中的速度和测试后的速度共同选择1 mm/s，压缩百分比为50%，停留时间为5 s；破断强度为测试过程中第一个出现的峰的最大力，凹陷深度为第一个峰对应的压缩距离，破断强度与凹陷深度的乘积即为求得的凝胶强度值[13]。

1.2.5 持水性的测定 将混合鱼糜凝胶切成大约3 mm 厚度的薄片并称重量（W1），先将3 张滤纸置于下方，上面再放2 张滤纸，用5 kg的重物压制并保持2 min，取出滤纸，再次称重（W2），持水性按式（1）计算[14]:

式中：W1—第一次称重的质量（g）；W2—第二次称重的质量（g）。

1.2.6 白度的测定 将混合鱼糜凝胶切成约5 mm厚度的薄片，白度值需要用全自动测色色差计来测定，混合鱼糜凝胶样本每一个取3 片，每片测定5 次，取5 次测试值得平均值。白度按式（2）计算[15]：

注：L*—亮度；a*—正值偏红，负值偏绿；b*—正值偏黄，负值偏蓝。

1.2.7 质构的测定 将混合鱼糜凝胶切成高为20 mm的圆柱体，各组鱼糜平行测定5 次，选择用5 mm的通用柱形探头的质构仪,测试前的速度选择为2.00 mm/s,测试中的速度为1.00 mm/s,选择测试后速度为1.00 mm/s,选择压缩百分比为50%,并且两次压缩间隔的时间为5.00 s,触发力5.0 g[16]。

1.2.8 SDS-PAGE 凝胶电泳分析 称取3 g 混合鱼糜凝胶样品，切碎后置于27 mL，85 ℃的5%的SDS 溶液中，均质15 min 后，将含有均质液的离心管放于85 ℃的水浴锅中保温1 h，冷却后在25 ℃，4000 r/min 下离心10 min，取上清液，与上样缓冲液按1:1 比例混合，沸水浴4 min，采用8%分离胶和5%浓缩胶进行电泳分离，蛋白上样量为 15 μL。电泳结束后用0.1%（m/V）的考马斯亮蓝 R-250 染色液（含有50%的甲醇，10%的乙酸）染色1 h，然后用脱色液（含有50%的甲醇，10%的乙酸）蛋白质条带清晰即为脱色成功[17]。

1.2.9 扫描电镜（SEM）微观结构观察 参考余永名等[18]的方法，略作修改。将混合鱼糜凝胶切成3 mm×3 mm×3 mm 小块，用 2.5%的戊二醛固定12 h，去除固定液后用磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L，pH7.2）漂洗3 次，每次5 min，再分别用体积分数为 30%、50%、70%、90%、95%和100%的乙醇各脱水一次，15 min/次，再将样品放入真空冷冻干燥机中干燥8 h，离子溅射镀金，用扫描电子显微镜观察微观结构。

1.3 数据处理

采用Excel 2010 软件处理数据和绘图，选用SPSS 21.0 软件对数据进行方差分析（ANOVA），P<0.05 为差异性显著。所有指标检测均测定三次取平均值[19]。

2 结果与分析

2.1 不同加热方式对混鱼糜凝胶强度的影响

凝胶强度即凝胶破断力和破断距离的乘积，是反映复合鱼糜凝胶性能的一个重要指标[20]。由图1可知，不同加热方式对混合鱼糜凝胶强度影响力不同，水浴微波联用法加热的混合鱼糜凝胶强度显著（P<0.05）高于其余四种方法制备的混合鱼糜凝胶强度。水浴微波联用的混合鱼糜凝胶强度相比于传统水浴二段法增强了22.4%，较单独微波加热法增强了14.8%，与高压熟制法相比增强了34.9%，比蒸汽加热法增强了43.9%，而凝胶强度增强是由于混合鱼糜在经过40 ℃水浴1 h的低温凝胶化后，再用微波炉快速加热使混合鱼糜快速经过凝胶劣化阶段，进而改善混合鱼糜凝胶强度，使混合鱼糜凝胶强度达到最优值。

图1 不同加热方式对混合鱼糜凝胶强度影响Fig.1 Effect of different heating modes on gel strength of mixed surimi gel

2.2 不同加热方式对混合鱼糜凝胶持水性的影响

混合鱼糜凝胶持水性是指鱼糜凝胶经过重力压制前后能将水分保持在其微观结构中的能力[21]，是判断混合鱼糜凝胶优劣的一个重要参数，较高的持水性是优质混合鱼糜的重要特点，其值越高表示凝胶中游离水份越少。通过图2 可以明显看出，加热方式显著影响（P<0.05）混合鱼糜凝胶的持水性，根据朱玉安等[22]研究表明，微波加热法制备的鱼糜在蒸制和煮制中持水性最大，而本文在此基础上选择五种加热方式，并将水浴和微波联用，此时水浴微波联用组制备的混合鱼糜凝胶持水性高于其他四组加热方式。水浴微波联用法制备的混合鱼糜持水性高是因为鱼糜从溶胶变为凝胶的过程中，鱼糜中肌原纤维蛋白在前期低温水浴过程中充分展开，有助于后期微波加热中蛋白间的交联作用，相对于其他四种加热方式，水浴微波联用加热可以使鱼糜凝胶结构更为紧密（图5c）将鱼糜凝胶中的水分保留的更高。

图2 不同加热方式对混合鱼糜凝胶持水性影响Fig.2 Effect of different heating modes on water holding capacity of mixed surimi gel

2.3 不同加热方式对混合鱼糜凝胶白度的影响

由图3 看出，不同加热方式下加热的混合鱼糜凝胶白度有所不同，水浴微波联用法制备的混合鱼糜凝胶白度值显著（P<0.05）高于水浴二段加热、微波加热、蒸汽加热以及高压法。因为高温处理不仅影响混合鱼糜凝胶中水分子的重新排列，而且破坏蛋白质分子间的非共价键，影响共价键的破坏和形成，两者都会改变凝胶的白度。陈海华等[23]研究指出鱼糜凝胶的白度变化与蛋白变性的程度有关，而水浴微波联用法法可以使混合鱼糜凝胶快速经过凝胶劣化温度段，减小蛋白质变性，所以白度也会高于其他加热方法。

图3 不同加热方式对混合鱼糜凝胶白度影响Fig.3 Effect of different heating methods on the whiteness of mixed surimi gel

2.4 不同加热方式对混合鱼糜凝胶质构的影响

由表2 可知，五种不同的加热方式对混合鱼糜凝胶的硬度、弹性、胶粘性、咀嚼性和内聚性等质构特性有显著（P<0.05）影响。对于不同加热方式下的混合鱼糜凝胶的硬度值，由大到小排列为：水浴微波联用>微波加热>高压熟制>水浴二段加热>蒸汽加热，且水浴微波联用法制备的混合鱼糜凝胶硬度显著（P<0.05）高于其他方法。水浴微波联用法中先在40 ℃水浴下1 h，这一阶段添加物谷氨酰胺转氨酶（TGase）催化鱼糜蛋白分子之间形成ε-（γ-谷氨酰胺）赖氨酸共价交联键，随后因为微波加热时间快速的特点使形成的ε-（γ-谷氨酰胺）赖氨酸共价交联键不易被分解[24]，可以让混合鱼糜形成稳定且致密的三维网状结构（如图5c 所示），增强其持水性进而增强混合鱼糜凝胶硬度[25]。而不同加热方式下的混合鱼糜凝胶的弹性、胶粘性、咀嚼性的值由大到小排列为：水浴微波联用>微波加热>水浴二段法加热>高压熟制>蒸汽加热，且水浴微波联用下混合鱼糜凝胶的弹性、胶粘性、咀嚼性显著（P<0.05）高于其他加热方式，这可能使由于微波加热可以使混合鱼糜快速经过凝胶阶段，减少劣化现象，所以微波方式在加热过程中可以在短时间内制备出凝胶特性较好的混合鱼糜凝胶。对于鱼糜的内聚性，不同加热方式的混合鱼糜凝胶没有显著性变化（P>0.05）。

表2 不同加热方式对混合鱼糜凝胶质构的影响Table 2 Effects of different heating modes on gel texture of mixed surimi gel

2.5 不同加热方式的混合鱼糜凝胶SDS-PAGE 凝胶电泳

由图4 可知，水浴微波联用混合鱼糜凝胶（第1 道）和水浴二段加热混合鱼糜凝胶（第2 道）其肌球蛋白重链（MHC）条带明显细于微波加热，因为微波加热速度快的特点，使鱼糜快速通过凝胶化，而水浴二段法和水浴微波联用法都会使鱼糜在40 ℃下MHC 充分交联，MHC的数量会随着低温凝胶化时间的延长而减少，形成 MHC 聚集体，MHC 聚集体因分子过大而无法进入分离胶[26−27]。但是蒸汽加热混合鱼糜凝胶（第4 道）和高压熟制混合鱼糜凝胶（第5 道）的MHC 完全消失，说明这两种方法制备得混合鱼糜凝胶蛋白质发生了降解现象。水浴微波联用法制备的混合鱼糜凝胶（第1 道）其肌动蛋白（Actin）含量显著多于其他四种加热方式，在鱼糜肌原蛋白中，肌球蛋白和肌动蛋白含量占75%，肌球蛋白重链（由肌球蛋白和肌动蛋白组成）是与鱼糜凝胶化过程相关的重要蛋白质[27−28],由以上结论可得出水浴和微波联用法制备的混合鱼糜凝胶蛋白质保留程度显著高于其他四组加热方式。

图4 混合鱼糜凝胶SDS-PAGE 图Fig.4 SDS-PAGE of mixed surimi gel

2.6 不同加热方式的鱼糜凝胶扫描电镜微观结构观察

由图5a 可知，传统水浴加热的混合鱼糜凝胶网状结构较为稀疏，有较大的孔洞且空隙较大，这样的网络结构不牢固，不能抵抗外界施加的力，造成持水能力减弱，而图5d 中通过蒸汽加热法制备的混合鱼糜凝胶的凝胶结构呈现出大小不一的凝胶孔洞，凝胶网络的致密性下降，且可以观察到部分组织有断裂的现象，使得混合鱼糜凝胶的持水力、凝胶强度、弹性等下降。图5e 中混合鱼糜凝胶在高压条件下，混合鱼糜凝胶网状结构较为致密，但是表面较为粗糙，有少许孔隙，这可能由于水分状态和蛋白质结构在高压处理后的鱼糜中发生了变化的结果[29]，这与前面持水性结果吻合。由图5b 和图5c 可以看出，单独微波和水浴微波联用下的混合鱼糜凝胶孔隙较小结构较为紧密，可以形成均一稳定的结构，这可能是因为快速微波加热产生的热效应使聚集的蛋白质发生膨胀，这样可以让鱼糜吸收足够热量，显著提高了断裂力和的影响研究[J].食品科技，2018，43（10）：195−199.［Zheng J,Ma A N,Hu A J,et al.Effect of heating method on quality of compound vegetable fish pills[J]. Food Technology，2018，43（10）：195−199.］

图5 不同加热方式的鱼糜凝胶的微观结构图Fig.5 Microstructure of surimi gels with different heating modes

［5］曹洪伟.微波对鱼糜加工过程中肌球蛋白和关键酶结构的影响[D].无锡:江南大学,2019.［Cao H W.Effects of microwave on myosin and key enzymes structure in surimi processing[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.］形变力[30]，但是两种微波加热方法中，水浴微波联用法制备的混合鱼糜凝胶相对于单独微波加热表面较为平滑，结构更为紧密，这可能是因为前期1 h的低温凝胶化阶段，有效提高混合鱼糜凝胶的质构特性。通过观察混合鱼糜凝胶微观结构，水浴微波联用法凝胶结构最致密，可以制备出凝胶特性强的混合鱼糜凝胶。

3 结论

在5 种不同加热方式中，水浴微波联用法制得的混合鱼糜制品持水力为94.33%，白度为83.75，凝胶强度为2979.47 g·cm，硬度为21.50 N，弹性4.30 mm，胶粘性20 N，咀嚼性49.27 mJ 均显著（P<0.05）高于其他加热方式所制得的混合鱼糜凝胶，并通过扫描电镜图显示水浴微波联用法制备的混合鱼糜凝胶三维网状结构紧密，凝胶孔洞较小且表面平滑，结合SDSPAGE 凝胶电泳分析得出，水浴微波联用法制得的混合鱼糜凝胶主要蛋白质成分保留较好。在五种加热方式中水浴微波联用法可以制备出品质优良的混合鱼糜凝胶制品，可为混合鱼糜制品的改良提供参考。