DGCR8基因对小鼠生长受限的影响

田捧，郭玉琪，郭智宽

(1.郑州大学第三附属医院 a.超声科；b.中医科，河南 郑州 450052；2.河南省人民医院 妇产科，河南 郑州 450003)

胎儿生长受限(fetal growth restriction，FGR)是指足月胎儿出生体质量小于2 500 g，或胎儿体质量低于同孕龄平均体质量的两个标准差，或低于同孕龄正常体重的第十百分位数[1]。FGR不但影响胎儿的生长发育，还会导致青少年期的体格和智力发育受损，甚至可能发生脑性瘫痪，成年后心血管、神经系统和代谢性疾病发病率升高[2-3]。很多因素可造成FGR，FGR的发病机制一直是产科、儿科等相关领域的研究热点。DGCR8是参与miRNA合成与成熟的重要蛋白，可调控miRNA的生成，影响miRNA对基因的调控作用[4]。miRNA是近年新发现的一种非编码RNA，是一类长约22个核苷酸的非编码的单链RNA大家族，参与多种生物过程。近年研究表明，miRNA在生长和发育中扮演着重要角色[5]。miRNA与FGR存在相关性。因此，本研究推测可以通过干预DGCR8的表达，调控miRNA的表达，分析DGCR8对胎儿生长发育的影响。本研究为FGR的治疗和产前筛查找到新的靶点，具有重要的理论意义和临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和实验仪器DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素、硫酸链霉素均购自美国Life Technologies公司，胰蛋白酶、兔抗DGCR8多克隆抗体、兔抗磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracellular regulated kinase，p-ERK)多克隆抗体均购自美国Centocor公司，蛋白提取试剂盒、蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA)均购自美国Pieree公司，离心机(型号M162856)、蛋白印迹电泳仪(型号BLY-DYCP-38C)、蛋白印迹转膜仪(型号1704150)。

1.2 实验动物动物实验方案经美国田纳西大学动物管理委员会审核通过。选用同一窝出生的14日龄的转基因小鼠(品系批次：C57BL/6SvJ，小鼠模型由美国田纳西大学科学健康中心郭玉琪与岳军明教授联合共建实验室提供)，在SPF级、温度保持在22～28 ℃、相对湿度维持在40%～60%的动物房饲养。

1.3 可诱导型DGCR8基因敲除小鼠的制备选用可诱导型的Cre转基因小鼠，该Cre酶的表达由可诱导型的β-actin启动子控制，并含有雌激素受体序列，对他莫昔芬敏感，可通过控制他莫昔芬的剂量对小鼠进行可诱导性基因敲除。将含有β-actin-Cre-ERT2启动子的转基因小鼠和DGCR8loxp/loxp小鼠交配，获得DGCR8loxp/loxp/actin-cre和DGCR8loxp/loxp小鼠[以上小鼠的基因型均由聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测确认]。将两种不同基因型的同一窝出生的小鼠分为对照组和实验组进行饲养(共选择3窝小鼠重复实验，第1窝符合实验基因型要求的共4组8只，第2窝3组6只，第3窝3组6只)，实验组和对照组小鼠均在小鼠生后第14天注射4 mg他莫昔芬(扬子江药业集团有限公司，08022501)[6-7]，选择14日龄生长发育旺盛期的小鼠进行实验。首次称14日龄小鼠的体质量，以后每3 d对两组小鼠分别进行称重，记录数据。

1.4 Mef细胞的制备取基因型分别为DGCR8loxp/loxp和DGCR8loxp/loxp/actin-cre小鼠胚胎(PCR反应检测小鼠胚胎的基因型，体系由基因组DNA、引物、PCR buffer、25 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1dNTP、ddH2O和Taq酶组成。反应条件为95 ℃退火，55 ℃复性，75 ℃延伸，进行30个循环。所得产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，于紫外灯下观察结果)。新鲜小鼠胚胎在37 ℃酶消化液中孵育8～10 min，在DMEM培养基中清洗3次，置于37 ℃，体积分数为5% CO2细胞培养箱中孵育1 h，用巴氏吸管反复吹打组织，使组织块均匀分散成细胞层，1 500 r·min-1离心5 min，弃去上清，加入DMEM培养基重悬细胞，重复3次后，加入DMEM培养基(10% FBS+1%青链霉素)将细胞置于37 ℃，体积分数为5% CO2细胞培养箱中培养。

1.5 Western blot在基因型为DGCR8loxp/loxp和DGCR8loxp/loxp/actin-creMef细胞中分别加入他莫昔芬，他莫昔芬按能敲除DGCR8基因的最低剂量0.5 μmol·L-1的浓度添加。待细胞生长密度达到80%～100%时，刮下细胞并转移至1.5 mL离心管，加入80～100 μL裂解液，冰上裂解10 min，13 000 r·min-1离心10 min，取上清液保存于-80 ℃冰箱。1.5 mL离心管中加入800 μL ddH2O和200 μL Protein Assay Dye Reagent，加入1 μL蛋白样品，混匀后用紫外分光光度计检测595 nm波长条件下吸光度值，根据标准曲线计算蛋白含量。处理好的蛋白样品，按照每孔40～100 μg上样，浓缩胶80～100 V电泳，分离胶100～120 V电泳。电泳结束后，将蛋白样品转移至NC膜或PVDF膜，25 V转膜2 h，5%脱脂乳封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜3遍后加二抗孵育1 h，显影，定影，曝光条带。

2 结果

2.1 他莫昔芬筛选的最低剂量Western Blot结果显示，当加入浓度为0.5 μmol·L-1他莫昔芬时，DGCR8基因已经被完全敲除。见图1。

图1 加入不同浓度的他莫昔芬处理Mef细胞48 h DGCR8基因敲除效果

2.2DGCR8基因敲除小鼠生长速度DGCR8基因敲除组小鼠生长发育速度低于对照组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、图2。

表1 实验组和对照组小鼠体质量比较

图2 实验组和对照组小鼠生长曲线

2.3DGCR8基因敲除小鼠p-ERK1/2、PCNA蛋白表达水平Western blot结果显示，DGCR8基因敲除组p-ERK1/2、PCNA蛋白的表达低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、4。

图3 实验组和对照组p-ERK1/2的表达

图4 实验组和对照组PCNA的表达

3 讨论

FGR是产科的严重并发症，我国FGR的发生率为6.39%，可导致围生儿发病率增高4～6倍[8]，是导致围生儿死亡的主要原因之一[9]，能导致早产、窒息以及脑瘫等[10]。FGR是一种复杂的疾病，其病因多样，迄今尚未完全阐明。

DGCR8是位于人类22号染色体q11.2区域的一个等位基因，是双链miRNA结合蛋白，它与RNA酶Ⅲ Drosha相互作用，促进miRNA的成熟，影响miRNA对基因的调控作用[11]。研究显示，miRNA参与调控胎儿发育和妊娠病理结局[12]，miRNA的表达变化与FGR、胎膜早破、子痫前期和巨大儿等妊娠病理结局密切相关[13]。Maccani等[14]研究了人类胎盘中的 107个调节细胞生长与分化的miRNA，其中miR-16、miR-21、miR-93、miR-135b、miR-146a和miR-182与胎儿生长存在相关性。Mouillet等[15]对正常妊娠孕妇和妊娠合并FGR孕妇血浆中部分缺氧相关miRNAs的表达进行了比较，结果显示，FGR组总miRNA表达较正常妊娠组高1.8倍。此外国内一项研究显示，miR-210可能参与了FGR的发病，循环中miR-210可作为FGR诊断的生物标志物[16]。miRNA与FGR存在一定的相关性，循环中miRNA的表达可作为FGR诊断的生物标志物。基于以上理论，本研究推测DGCR8可能与FGR密切相关，但是目前国内外针对DGCR8与FGR的研究尚未见报道。本研究旨在探讨DGCR8基因对FGR的影响及其作用机制，以期为FGR寻找到新的发病机制及基因靶点。

细胞外调节蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶家族成员之一，被激活后成为p-ERK，可介导信号由胞浆向胞核传递，参与调节细胞的生长、发育、分化和凋亡等多种生理过程[17]。PCNA与细胞增殖状态高度相关，是衡量细胞增殖能力的重要标志物[18]。本研究构建DGCR8基因敲除小鼠并提取DGCR8基因敲除Mef细胞，结果显示DGCR8基因敲除小鼠出现了生长发育迟缓，DGCR8基因敲除Mef细胞中p-ERK、PCNA细胞信号通路蛋白表达下降，因此我们推测DGCR8通过调控p-ERK、PCNA的表达影响细胞的生长、增殖、分化等，从而影响小鼠的生长发育，DGCR8与生长受限存在相关性。然而本研究只是在小鼠和细胞水平进行了初步的验证，其在胎儿体内的表达水平是否存在差异，还需要临床实验进一步研究。

综上所述，DGCR8基因敲除小鼠生长受限，发育迟缓，DGCR8可能是通过调控Mef细胞中p-ERK、PCNA相关信号通路来发挥作用。据此，我们有望通过检测母体血清或相关组织中DGCR8的表达，预测胎儿宫内生长受限，以便临床早期采取有效的干预措施，从而为胎儿宫内生长受限的早期诊断、预防、治疗提供新的思路。