禽蛋中呋喃唑酮代谢物（AOZ）残留量的酶联免疫检测

贺燕，王益军，张苏珍，葛敏，谭海荣

（连云港市畜产品质量监督检验测试中心 江苏连云港 222001）

呋喃唑酮又称痢特灵，是人工合成的广谱抗菌药物，属硝基呋喃类药物，它有非常好的抗菌效果和药代动力学的特性[1]，曾经被广泛应用于畜牧业，它还可以作为猪、禽类和水产促生长的添加剂。但在长时间的实验室研究过程中发现，硝基呋喃类的药物和代谢物均可使实验动物发生癌变和基因突变，因此，此类药物禁止在治疗和饲料中使用[2]。自1993年起，欧盟范围内便禁止在动物饲养中使用硝基呋喃类药物盐酸呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，而呋喃唑酮也从1995年起被禁用。我国农业部第235号公告中也规定动物性食品中呋喃唑酮检出限为不得检出[3]。

硝基呋喃类药物在体内迅速代谢，在组织中与细胞膜蛋白结合长期持续存留，因此在分析此类药物的残留时以分析代谢物为主[4]。目前，动物组织中呋喃唑酮代谢物（AOZ）残留分析主要采用高效液相色谱法（HPLC-MS）、液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）和酶联免疫法（ELISA)。前者由于需要复杂的仪器设备、繁琐的前处理过程及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查，而以抗原抗体特异性反应为基础的酶联免疫法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，已在农兽药残留检测中得到广泛应用[1]。本文利用酶联免疫方法对禽蛋中AOZ的残留量进行检测，为禽蛋中呋喃唑酮类药物残留监控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

禽蛋市场随机采样。

呋喃唑酮代谢物（AOZ）ELISA检测试剂盒（包括包被有偶联抗原的96孔酶标板），质量浓度分别为0、25、50、100、200、400ng/L的AOZ标准液，酶连接物，抗体液，底物/发色剂溶液，反应终止液，洗涤缓冲液（盐），2-硝基苯甲醛购自德国拜发公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

匀浆机（九阳JYL-C 16V）；电子天平（德国赛多利斯）；数显振荡摇床（德国IKA）；恒温培养箱（上海博泰）；漩涡混合器（德国IKA，MS3 basic）；高速冷冻离心机（德国sigma）；氮吹仪（美国Organomation）；微量移液器（单道20～200μL、200～1,000μL，多道50～300μL）；微孔板酶标仪（赛默飞Mu ltiskan FC 450nm）；超高效液相三重四级杆串联质谱仪（美国Waters公司）。

1.3 试剂配制

1mol/LHC l溶液：量取90mLHC l，缓慢注入910mL水中；10mmol/L2-硝基苯甲醛：7.6mg 2-硝基苯甲醛溶于5mL二甲基亚砜；0.1mol/LK2HPO4：准确称取14.6g K2HPO4溶于1,000mL水；1mol/LNaOH：准确称取40g NaOH溶于1,000mL水。

1.4 方法

1.4.1 样品前处理称取（1.00±0.05g）匀浆后的样品至50mL聚苯乙烯离心管中，加入3.9mL蒸馏水，0.5mL 1mol/L的HC l和200μL 10mmol/L 2-硝基苯甲醛振荡混合；50℃条件下孵育3h或者37℃条件下隔夜（约16h）孵育；加入5mL 0.1mol/LK2HPO4，0.4mL 1mol/LNaOH和5mL乙酸乙酯，振荡混合30s（样品加热至最多50℃，以获得更好的分层效果）；离心10min/3000g/室温（20～25℃）；取2.5mL乙酸乙酯层（上层）溶液加入到新的容器中（样品浓度过高时，要适当减少乙酸乙酯的取样量），蒸干，干燥物用1mL正己烷溶解，加入1mL样品缓冲液彻底混合；然后离心10min/3000g/室温（20～25℃）；取50μL下层水相进行检测。

1.4.2 检测原理检测的基础是抗原抗体反应，微孔板包被有针对AOZ抗体的捕获抗体。加入标准品、样品溶液、AOZ酶连接物及AOZ抗体，游离的AOZ与AOZ酶连接物竞争AOZ抗体结合位点（竞争性酶免疫分析）。同时AOZ抗体也与微孔板上固定的捕获抗体结合，没有结合的AOZ酶连接物在洗涤步骤中被除去。将底物/发色剂加入到孔中并且孵育，结合的酶连接物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后使颜色由蓝色转变为黄色，在450nm处测量。吸光度值与样品中的AOZ浓度呈反比。

1.4.3 ELISA检测步骤使用之前将所有试剂回温至室温（20～25℃）；将足够标准品和样品检测所需数量的孔条插入微孔板架，均做两个平行实验，记录下标准品和样品的位置；加入50μL标准品或处理好的样品溶液到相应的微孔中，不同样品或标准品的添加换用新的移液头；加入50μL酶连接物溶液，再加入50μL抗体溶液，轻轻振荡充分混合，置20～25℃避光环境下孵育1h；倒出孔内液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，加入250μL洗涤缓冲液，充分洗涤3次，每次间隔10s，用吸水纸拍干；加入100μL底物/发色剂，轻轻振荡充分混合，置20～25℃避光环境下孵育15min；加入反应终止液100μL，轻轻振荡充分混合，于450nm处测量吸光度（在加入反应终止液后30min内读数）。

1.4.4 标准曲线的建立使用R-BiopHa rm德国拜发公司专门为RIDASCREEN系列产品设计的应用软件来进行结果分析。对单次检测建议使用Log it/log曲线进行结果分析，对两次或多次平行检测应该使用Cub ic Sp line曲线进行结果分析。

2 结果与分析

2.1 ELISA标准曲线

按照酶联免疫分析步骤，分别测定浓度为0、25、50、100、200、400ng/LAOZ标准液的吸光度值，采用RIDASCREEN数据分析软件建立标准曲线如图1。

图1 RIDASCREEN数据分析软件建立标准曲线

2.2 精密度和准确度

取空白鸡蛋样本，以0.2、0.4、0.6μg/kg 3个添加量的AOZ对其进行添加回收试验，ELISA法测定的准确度以回收率表示，精密度以变异系数表示，每个添加量做5个平行，结果见表1。

由表1可知，以0.2、0.4、0.6μg/kg 3个添加量的AOZ对空白鸡蛋进行添加，其加标回收率为77.7%～101.8%，批内变异系数为0.4%～7.0%。

表1 试剂盒的准确度和精密度实验（n=3）

2.3 检测限

对20份空白样品进行检测，从标准曲线上得出样品质量浓度，以20份样品AOZ质量浓度的平均值（X ）和标准差（s）表示检测限（MDL），即MDL=X +3s，该方法对鸡蛋样品的检测限为0.1μg/kg。

2.4 方法特异性

试剂盒特异性由交叉反应率表示。由表2可知，该试剂盒与AOZ原药有一定的交叉反应，交叉反应率为1.2%，这可能是因为AOZ与其原药有类似的结构，而对其他呋喃类药物及其代谢物的交叉反应率均较低，表明本试剂盒具有良好的特异性。

表2 试剂盒特异性试验

2.5 ELISA法与LC-MS/MS法检测结果比较

利用ELISA和LC-MS/MS对20份（分别编号01～20）禽蛋样品进行测定，结果见表3，用ELISA法检测，阴性样品18份，阳性样品2份（含量大于0.5μg/kg），相同样品经LC-MS/MS方法（农业部781号公告-4-2006动物源食品中硝基呋喃类代谢物（AOZ）残留量的测定高效液相色谱-串联质谱法）测定后，18份阴性样品均为阴性，2份阳性样品均为阳性，阴、阳性判断结果一致。比较结果见表3。

由表3可知，用ELISA法与LC-MS/MS法的测定结果相符，没有发现假阳性和假阴性样品，ELISA法适用于禽蛋中AOZ残留量检测的筛选。

表3 ELISA法与LC-MS/MS法检测结果比较

3 讨论

3.1 样品的衍生化与前处理

在AOZ的检测中，一般先加入衍生化试剂进行衍生。这主要是由于AOZ的分子量较小，不易被检测。而在37℃或50℃酸性条件下，加入衍生化试剂2-硝基苯甲醛（使用前必须新鲜配制），形成衍生产物2-NP-AOZ，分子量增大，大大提高了检测灵敏度。目前采用的有常规衍生化方法，即在37℃孵育过夜，37℃孵育过夜至少16h，导致衍生化过程是整个样本处理的限速环节；高温短时间方法，即在50℃孵育3h，可缩短样本处理时间。加入乙酸乙酯后振荡不能过于激烈且时间不宜过长，否则容易乳化，影响样品分层。

3.2 稀释倍数对检测结果的影响

运用酶联免疫法检出超过曲线最高点的阳性样品，这时得到的数据往往不准确，只能起到定性的作用，为提高检测结果准确性，根据所得吸光度值判断需要稀释倍数，稀释后重新测定。

由表4可知，超出曲线最高点的阳性样品，可通过减少提取液乙酸乙酯的量，增大样品稀释倍数，或者直接稀释样品检测液，保证稀释后的检测浓度在标准曲线范围内，才能得到相对准确的检测结果。

表4 不同稀释倍数对检测结果的影响

3.3 方法应用前景

运用酶联免疫法对禽蛋中AOZ残留进行筛选，能在短时间内检测几十到上百个样品，且不需要复杂的仪器设备，样品前处理简单，检测成本低，是药物残留检测发展的趋势，但目前筛选法的检测标准极少，检测限（即阳性浓度标准）不统一，给检测结果判定带来一定困难，对筛选可疑结果需用确证方法进行确证。酶联免疫法作为一种快速筛选手段，在现场监控和基层检测中有着广阔的推广应用前景[5]。

4 小结

通过酶联免疫法对禽蛋中AOZ残留进行检测，测定结果准确，样品的最低检测限为0.1μg/kg，当添加0.2、0.4、0.6μg/kg时，加标回收率为77.7%～101.8%，变异系数为0.4%～7.0%。阳性样品经液相色谱串联质谱方法确证，检测结果相符，没有发现假阳性和假阴性样品。酶联免疫检测方法，检测灵敏度和定量线性范围均达到检测限量要求，且样本前处理操作快速简单、检测成本低、仪器设备投资少，适合于大量样本中AOZ残留量检测的快速筛选。█