延边圈养黑熊熊源葡萄球菌分离鉴定

闵鹏飞，千慧燕，杨冰祎，宋建臣，贾立军*,刘德志

1.延边大学农学院动物医学系，吉林延吉 133000；2.吉林省磐石市富太镇畜牧服务站，吉林磐石132307

葡萄球菌是一种非常常见的人兽共患病原菌，隶属于芽孢杆菌目细球菌科葡萄球菌属，细菌形态通常为圆形或卵圆形，常呈葡萄串状排列，无芽孢，无鞭毛，无荚膜。革兰氏染色阳性。近期吉林省延边朝鲜族自治州某熊场发现一只不明原因死亡的黑熊。经过现场的初步诊断与勘察，并结合该死亡黑熊生前的临床症状、现场的初步解剖结果判断，怀疑该死亡黑熊生前很可能感染疑似葡萄球菌的病原菌。为进一步确定病因、诊治和预防黑熊的传染性疾病。本研究利用实验室诊断方法进行了分离纯化、生物化学鉴定、16S rRNA分子鉴定等操作。通过上述实验得到的数据再结合临床症状以及解剖结果，我们最终确定该菌株为金黄色葡萄球菌。本试验的顺利进行对葡萄球菌的研究工作做出了一定贡献。

1 材料与方法

1.1 试验动物

此次试验的实验动物来自于延边某熊场，现场采集死亡黑熊的肝脏、脾脏等实验材料。

1.2 主要试剂

生化鉴定管、营养琼脂、药敏纸片、质粒小提试剂盒、生化试剂管、血琼脂平板、革兰氏染色液等。细菌16S rRNA通用引物由生工生物技术有限公司合成。其它实验所用到的试剂均由延边大学预防兽医实验室提供。

1.3 细菌的分离纯化

将熊场采集的黑熊脏器放置于超净工作台上进行进一步处理。用接种环取样后，分别划线接种于营养琼脂培养基、血琼脂平板培养基和高盐甘露醇培养基。将上述培养基放入恒温培养箱中培养24 h。24 h后用接种环挑取培养基上生长良好的单个菌落,接种于3 mL的LB液体培养基中37 ℃震荡培养一夜后进行革兰氏染色镜检。

1.4 细菌的染色及形态观察

使用革兰氏染色法对分离菌株进行染色,并将染色后的载玻片放置于显微镜下观察。

1.5 细菌的生化鉴定

将纯化后的细菌制作成细菌悬液。准备五个试管，用记号笔分别做好标记，依次向五个试管中加入葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇五种糖溶液，并向五个试管中滴加0.4%的溴麝香草酚蓝作为指示剂。将配置好的细菌悬液滴入五个试管中，每管3滴。用封口膜封口，封口膜用75%酒精擦拭灭菌，接种完后放36±1 ℃培养24 h，观察结果。

1.6 16S rRNA分子鉴定

采用DNA提取试剂盒说明书对该菌株的DNA进行提取,运用细菌16S rRNA通用引物进行PCR鉴定。取PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。选取PCR阳性产物进行测序，将测序结果提呈NCBI进行对比。

1.7 药物敏感性实验

将氧氟沙星、复方磺胺甲唑、头孢呋辛、万古霉素、庆大霉素五种药物的药敏纸片放置于培养皿上，纸片之间距离应该大致相等。为使实验结果更加准确，应进行至少5组以上的实验，放好纸片后，将所有的培养皿倒置于37 ℃恒温培养箱中，24 h后观察结果。

1.8 小鼠致病性实验

取10只健康的1月龄昆明鼠，分成两个组，第一组5只昆明鼠分别腹腔注射0.5 mL提取完成的细菌悬液并做好标记。另一组5只昆明鼠分别腹腔注射0.5 mL的生理盐水作为对照组并做好标记。两组小鼠分放在10个鼠笼饲养，饲料、饮水、温度等饲养条件均相同。每日定期观察实验小鼠的死亡情况并做好纪录。

2 结果

2.1 剖检变化

死亡黑熊生前体温升高，呼吸次数及频率加快并伴随腹泻。排出黑色、水样稀便,全身皮肤颜色以及性状发生改变。剖检可见死亡黑熊肝脏表面出现灰白色的坏死点,脾脏、肾脏不同程度肿大，有紫黑色的出血点。

2.2 分离菌的培养及染色结果

分离所得的菌株，在营养琼脂培养基上生长良好，生成表面湿润光滑的圆形菌落，呈现浅黄色直径1～2 mm斑点状凸起。在血琼脂平板培养基形成金黄色、圆形、湿润凸起的大型菌落，菌落周围可见透明的溶血环。高盐甘露醇培养基的菌落形态与营养琼脂平板的菌落形态大致相同。显微镜下可观察到分离菌为革兰氏阳性球菌，染色为蓝紫色，无芽孢、无菌毛、无鞭毛。呈单个或多个聚集排列。多个细菌聚集时细菌形态类似于葡萄串状。

2.3 生化鉴定结果

五个试管颜色全部变为黄色，说明分离菌株分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇。且分离菌株分解上述五种糖后产生酸性物质但是不产生气体。

表格1 生化鉴定结果

2.4 PCR鉴定结果

将测序后得到的序列于NCBI上比对后发现，分离菌株的16s rRNA与金黄色葡萄球菌的16s rRNA核苷酸同源性为100%。

2.5 药物敏感性实验结果

除复方磺胺甲唑药敏纸片周围几乎不出现抑菌环外，其它种类的药敏纸片周围都出现大小不一的抑菌环。由此可以推断出，分离菌株对大多数种类的抗生素敏感性较强，对磺胺类药物的敏感性较弱。

2.6 小鼠致病性实验结果

实验组小鼠接种细菌悬液后表现明显，初期症状为精神沉郁，被毛凌乱，食欲减退。第3天开始陆续出现死亡现象，第5天实验组小鼠全部死亡。将小鼠脏器中分离的细菌镜检，结果与黑熊体内分离出的细菌形态一致。由此可说明黑熊体内分离出的细菌对小鼠有很强的致病性。

3 讨论

相关文献证明，金黄色葡萄球菌感染可以导致牛、羊身体多处淋巴结肿大且肝、肾等不同程度病变[1,2]。细菌培养以及革兰氏染色结果可表明该分离菌在普通琼脂培养基上可以生成光滑的S型菌落。且血琼脂平板及高盐甘露醇培养结果表明，分离菌具有高强度的耐盐性和溶血性。革兰氏染色结果表明分离菌为革兰氏阳性球菌，细菌排列形状与葡萄球菌排列形状基本相同。根据相关学者的研究[3]，金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率可以高达90.91%，且金黄色葡萄球菌对于磺胺类药物最不敏感。最终生化及PCR结果证实，分离菌的生化鉴定结果与金黄色葡萄球菌生化鉴定结果高度相似。16s rRNA结果显示分离菌核苷酸同源性与金黄色葡萄球菌核苷酸同源性为100%。小鼠致病性实验表明，分离菌株对昆明鼠有很强的致病性。综上所述，我们可以证实此次从死亡黑熊体内分离出来的细菌为金黄色葡萄球菌。

本次实验的成功进行对国内金黄色葡萄球菌的研究工作做出了补充与完善，为今后金黄色葡萄球菌的研究提供了较为详细的资料。尤其对未来东北地区特别是延边地区黑熊熊源葡萄球菌病的防治工作具有重要意义，对东北地区的黑熊养殖业做出了巨大的贡献。