HPLC法同时测定舒眠胶囊中4种成分

2021-10-26陈思颖聂开品王爱民李勇军

中成药 2021年10期

彭潇，雷艳，陈思颖，聂开品，杨纯，王爱民，李勇军*

(1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州贵阳 550004；2.贵州医科大学，贵州省药物制剂重点实验室，贵州贵阳 550004；3.贵州医科大学药学院，贵州贵阳 550004；4.贵州大隆药业有限责任公司，贵州贵阳 550004；5.毕节市第一人民医院，贵州毕节 551700)

舒眠胶囊为国家基本药物目录所收载的中药复方制剂[1]，由酸枣仁(炒)、柴胡(酒炒)、白芍(炒)、合欢花等8味药材组成，具有疏肝解郁、宁心安神的疗效[2]，主要用于肝郁伤神所致的失眠症，安全性和临床疗效较好，且应用广泛[3-5]。方中酸枣仁含有的斯皮诺素等黄酮类物质具有镇静催眠及抗抑郁药理作用[6]，白芍中芍药苷、芍药内酯苷等主要成分有抗惊厥等生物学效应，具有明显的镇静、抗抑郁活性[7]，合欢花总黄酮有抗抑郁作用，其中槲皮苷为镇静催眠的有效成分[8-9]。舒眠胶囊现行标准收载于《国家药品标准新药转正标准第33册》，仅对制剂中芍药苷进行了定量检测[10]，而含多种有效活性成分的中药复方制剂是通过多成分、多靶点联合作用起疗效，对其中某单一成分的定量检测并不足以全面评估制剂的质量的优劣及安全性、有效性与稳定性，多组分评价模式已成为发展趋势[11]。本实验采用HPLC法同时测定舒眠胶囊中芍药内酯苷、芍药苷、斯皮诺素、槲皮苷的含量，以期为该制剂的质量控制和评价奠定实验依据。

1 材料

1.1 仪器 UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；AE-240型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。

1.2 试药 15批舒眠胶囊(每粒装0.4 g，批号20160721、20160722、20160801、20171201、20171006、20171108、20171002、20170504、20170601、20170910、20170702、20170305、20170404、20170205、20170103)编号S1～S15，均由贵州大隆药业有限责任公司提供。酸枣仁、柴胡、白芍、合欢花、合欢皮、蝉蜕、僵蚕、灯心草均由贵州大隆药业有限责任公司提供，经贵州医科大学刘春花副教授鉴定为正品。芍药内酯苷、芍药苷、槲皮苷、斯皮诺素对照品均购于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%，批号分别为wkq18050205、wkq18032104、wkq18041101、wkq18060104。乙腈为色谱纯；甲醇、乙醇等试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters CORTECS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；流动相乙腈(A)-水(含0.1%磷酸)(B)，梯度洗脱(0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～16%A；30～40 min，16%～18%A；40～42 min，18%～95%A)；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长242 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液精密称取上述4种对照品适量，加甲醇分别制成每1 mL含芍药内酯苷2.362 mg、芍药苷2.560 mg、斯皮诺素0.945 mg、槲皮苷2.040 mg的贮备液，精密量取适量，置于5 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL分别含四者0.755 8、0.819 2、0.075 6、0.204 0 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液精密称取胶囊内容物1 g，置于磨口具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声(200 W、40 kHz)处理30 min，取出，放冷，50%甲醇补足减失的质量，摇匀，取上清液，0.2 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性样品溶液按照处方比例及制剂工艺，分别制成缺酸枣仁(炒)、缺白芍(炒)、缺合欢花的阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察取“2.2”项下各溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，发现阴性无干扰，各成分分离度良好(R>1.5)，表明该方法专属性良好，见图1。

1.芍药内酯苷 2.芍药苷 3.斯皮诺素 4.槲皮苷

2.3.2 线性关系考察精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量，甲醇制成不同质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.3.3 精密度试验精密称取胶囊(S3)内容物1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件进样测定6次，测得芍药内酯苷、芍药苷、斯皮诺素、槲皮苷峰面积RSD分别为2.0%、1.0%、0.62%、0.68%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验精密称取胶囊(S3)内容物1 g，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件进样测定，测得芍药内酯苷、芍药苷、斯皮诺素、槲皮苷含量RSD分别为1.8%、1.6%、1.4%、1.7%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验精密称取胶囊(S3)内容物1 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得芍药内酯苷、芍药苷、斯皮诺素、槲皮苷峰面积RSD分别为0.39%、0.49%、1.5%、0.85%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验精密称取4种成分含量已知的胶囊(S3)内容物6份，每份0.5 g，精密加入各对照品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率试验结果(n=6)

2.3.7 样品含量测定取15批胶囊，每批2份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果(n=2)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法筛选本实验首先考察了回流、超声提取，再考察了提取溶剂甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇、水，最后考察了提取时间30、60、90、120 min，最终确定采用50%甲醇超声提取30 min作为供试品溶液制备方法，此时指标成分提取率较高，峰形对称性较好。

3.2 色谱条件筛选本实验首先考察了艾杰尔Venusil XBP(L) C18、沃特世 Waters CORTECS C18色谱柱，然后考察了流动相甲醇-水、甲醇-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%磷酸)、乙腈-水(含0.1%甲酸)对色谱峰的影响，综合考虑指标成分分离度与峰形，结合基线平稳状况，最终确定采用Waters CORTECS C18色谱柱，并以乙腈-水(含0.1%磷酸)进行梯度洗脱。同时参考文献[12-13]结合二极管阵列检测器DAD全波长扫描，发现芍药内酯苷、芍药苷在230 nm左右均有最大吸收，而且大于260 nm后两者吸收均较弱；斯皮诺素、槲皮苷分别在260、345 nm左右有较大吸收，综合考虑峰高，最终选用242 nm作为检测波长，此时各成分峰形、分离度良好，阴性样品无干扰，专属性良好。

3.3 指标成分筛选本实验选择芍药内酯苷、芍药苷、斯皮诺素、槲皮苷作为指标成分，均是发挥抗抑郁、镇静催眠的主要活性物质[14-16]，这与舒眠胶囊用于治疗肝郁伤神所致失眠症相符。现代药理研究表明，酸枣仁中以酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B为代表的皂苷类物质也为其镇静安神的主要药效成分；柴胡中柴胡皂苷A、柴胡皂苷D等也具有抗抑郁、镇静镇痛药理活性[17-18]，但该类成分在紫外检测器上存在末端吸收，基线易漂移，受干扰较严重，故今后将采用蒸发光散射检测器对其进行研究。