扶正治癃颗粒提取、成型工艺的优化

马转霞， 孙岚萍， 顾志荣， 马天翔， 吕 鑫， 许爱霞， 葛 斌

(1.甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省人民医院药剂科，甘肃 兰州 730000)

扶正治癃方由黄芪、熟地、肉苁蓉3味中药组成，是甘肃省人民医院的临床经验方，具有补气温肾、补血养阴、补肾润燥等功效，常用于治疗前列腺增生等疾病。方中君以黄芪补气升阳、益气温肾、调节气血；臣以熟地填精益髓、补血养阴，肉苁蓉补肾、益精、润燥。全方以补肾为主，气血阴阳统调，标本兼治。研究发现，黄芪利尿机制为竞争性抑制Na+-K+-ATP酶活力，且黄芪皂苷可促进膀胱逼尿肌的收缩，缓解尿道内口括约肌紧张度，减轻前列腺增生排尿无力、排尿困难的症状[1]。熟地、肉苁蓉均含有黄酮、多糖、生物碱等多种化学成分，具有抑菌、抗炎、提高机体免疫的生物活性，可保护前列腺免遭细菌和其他病原微生物侵袭，解除尿路炎性梗阻，改善局部症状。

中医常将前列腺增生归为“癃闭”“淋证”等范畴，其发病基础为年老体衰、肾气亏虚，基本病理因素为瘀血、痰浊、湿热，常见发病条件为劳力过度、情志刺激、外感六淫、饮食不节等[2]。中药及复方制剂治疗该类疾病具有疗效确切、整体调节、毒副作用小、适合长期服用等诸多明显优势[3]。故拟将原汤剂制备成便于服用、携带与贮存的颗粒剂，以解决传统汤剂煎煮费时、繁琐，且药液味苦量大等问题。本研究采用正交试验、均匀设计优化提取及成型工艺，为扶正治癃颗粒的开发研究提供技术资料。

1 材料

1.1 仪器 LC-16型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；UV8100A型紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；BSA4202S-CW型电子天平(百万分之一，德国赛多利斯公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(西安超杰仪器有限公司)；DHG-9140A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；DD-5M型低速大容量离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；YC-1000型实验室喷雾制粒包衣机(上海雅程仪器设备有限公司)。

1.2 试剂与药物 黄芪(批号180606)、熟地(批号180602)、肉苁蓉(批号180201)均购于甘肃冠兰中药饮片有限公司，经甘肃中医药大学李硕副教授鉴定为正品，符合2015年版《中国药典》一部相关规定。5-羟甲基糠醛(批号CHB171016)、松果菊苷(批号CHB170302)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号CHB171102)、毛蕊花糖苷(批号CHB171103)、D-无水葡萄糖(批号CHB180115)、芦丁(批号CHB170303)对照品均购于成都克洛玛生物科技有限公司。预胶化淀粉、麦芽糊精、甘露醇、微晶纤维素均为药用规格。甲醇、甲酸为色谱纯(天津大茂化学试剂厂)；其他试剂均为分析纯(天津大茂化学试剂厂)；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化

2.1.1 HPLC法测定4种成分含量

2.1.1.1 对照品溶液制备 精密称取5-羟甲基糠醛、松果菊苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷对照品适量，置于25 mL量瓶中，甲醇超声溶解，定容至25 mL，即得(四者质量浓度分别为0.10、4.40、0.19、0.53 mg/mL)。

2.1.1.2 供试品溶液制备 取水煎液10 mL，置于100 mL具塞三角瓶中，精密加入15 mL甲醇，密塞，称定质量，超声(功率500 W、频率40 kHz、温度20 ℃)处理60 min，提取液冷却至室温，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取上清液，溶剂回收至干，残渣加纯化水溶解，转移至 25 mL量瓶中，纯化水洗涤并定容至刻度，即得。

2.1.1.3 色谱条件 WondaSil C18-WR色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相甲醇(A)-水(含0.1%甲酸)(B)，梯度洗脱(0～30 min，8%～62%A；30～32 min，62%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃；检测波长290 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.5-羟甲基糠醛 2.松果菊苷 3.毛蕊异黄酮葡萄糖苷 4. 毛蕊花糖苷

2.1.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1.1”项下对照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，各取10 μL，在“2.1.1.3”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.1.1.5 方法学考察 选择正交1号水煎液，按照2015年版《中国药典》四部指导原则进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验，测得RSD均小于1.88%，各成分平均加样回收率在99.39%～102.26%之间，表明仪器精密度、方法重复性良好，水煎液在室温下24 h内稳定。

2.1.2 总多糖含量测定

2.1.2.1 对照品溶液制备 精密称取5.00 mgD-无水葡萄糖对照品，置于50 mL量瓶中，纯化水振摇溶解，定容至刻度，即得。

2.1.2.2 供试品溶液制备 取1 mL水煎液至离心管中，加入无水乙醇适量，边加边搅拌，使其体积分数高于80%，放置过夜，滤过，残渣加热水溶解，转移至50 mL量瓶中，纯化水定容，即得。

2.1.2.3 吸光度测定 取对照品溶液、供试品溶液、纯化水(空白对照溶液)各1 mL，参照文献[4]中总多糖含量的检测方法，在486 nm波长处测定吸光度A。

2.1.2.4 线性关系考察 精密称取D-无水葡萄糖对照品溶液2、3、4、5、6、7、8、9 mL，置于10 mL量瓶中，纯化水定容至刻度，按“2.1.2.3”项下方法测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=63.184 0X-0.004 1(r=0.999 3)，在0.020 0～0.090 0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.2.5 方法学考察 选择正交1号水煎液，按照2015年版《中国药典》四部指导原则进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验，测得RSD均小于2.00%，平均加样回收率为101.39%，表明仪器精密度、方法重复性良好，水煎液在室温下24 h内稳定。

2.1.3 总黄酮含量测定

2.1.3.1 对照品溶液制备 精密取芦丁对照品10.00 mg至50 mL量瓶中，60%乙醇溶解并定容至刻度，即得。

2.1.3.2 供试品溶液制备 取4 mL水煎液至50 mL三角瓶中，沿壁缓缓加无水乙醇，边加边振摇，待沉淀完全后过滤，取上清液，定容至刻度，即得。

2.1.3.3 吸光度测定 同“2.1.2.3”项，参照文献[4]中总黄酮含量的检测方法，在510 nm波长处测定吸光度A。

2.1.3.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液2、3、4、5、6、7、8、9 mL，置于25 mL量瓶中，纯化水定容至刻度，按“2.1.3.3”项下方法测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(A)进行回归，得方程为A=11.939 0X-0.058 8(r=0.999 5)，在0.016 5～0.074 2 mg/mL范围内线性关系良好。

2.1.3.5 方法学考察 选择正交1号水煎液，按照2015年版《中国药典》四部指导原则进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验，测得RSD均小于1.94%，平均加样回收率为99.62%，表明仪器精密度、方法重复性良好，水煎液在室温下24 h内稳定。

2.1.4 干浸膏得率测定 取水煎液20 mL，置于已干燥恒重的蒸发皿中，95 ℃水浴蒸干后于105 ℃烘箱中干燥3 h，蒸发皿转移至干燥器内，待其冷却至室温后称定质量，计算干浸膏得率，公式为干浸膏得率=(干浸膏质量/药材总质量)×100%。

2.1.5 正交试验 依照处方配比称取相应中药饮片，选择煎煮时间(A)、加水量(B)、煎煮次数(C)作为影响因素，5-羟甲基糠醛(X1)、松果菊苷(X2)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(X3)、毛蕊花糖苷(X4)、总多糖(X5)、总黄酮(X6)含量及干浸膏得率(X7)作为评价指标，采用正交试验优化提取工艺[5]。因素水平见表2。

表2 提取工艺因素水平

2.1.6 数据处理 采用信息熵理论[6]确定各评价指标的权重系数，首先建立原始评价指标矩阵X，将其转换为概率矩阵P，计算各指标的信息熵(Hi)(Hi=[0.971 4 0.929 4 0.973 7 0.948 3 0.500 5 0.960 1 0.988 1])、i项指标的系数Wi(Wi=[0.039 3 0.096 8 0.036 1 0.070 9 0.685 9 0.054 8 0.016 3])，根据公式M=X1m×W1+X2m×W2+X3m×W3+…+Xnm×Wn计算综合评分M，结果见表3，方差分析见表4。由表3可知，各因素影响程度依次为C>A>B，即煎煮次数>煎煮时间>加水量；由表4可知，因素A、C有显著影响(P<0.05)，而B无显著影响(P>0.05)；各因素较高水平组合理论上为A3B3C3，结合生产成本考虑，最终确定为A3B3C2，即加10倍量水煎煮2次，每次2 h。

表3 正交试验设计与结果

表4 方差分析

2.1.7 验证试验 按处方配比称取相应中药饮片3份，按“2.1.6”项下优化工艺进行验证试验，结果见表5。由此可知，3批样品综合评分及各指标成分得率的RSD均小于3.00%，表明该工艺稳定可行，可用于扶正治癃方的工业化提取。

表5 提取工艺验证试验结果(n=3)

2.2 成型工艺优化

2.2.1 颗粒制备 按处方量称取相应中药饮片，按“2.1.6”项下优化工艺制备水煎液，浓缩，喷雾干燥后制得干燥恒重的浸膏粉。取相应比例的浸膏粉与辅料混合，因前者黏性较大，故以95%乙醇为润湿剂制软材(“握之成团，触之即散”)，过20目筛，湿法制粒，在60 ℃烘箱中烘干整粒，即得。

2.2.2 指标测定

2.2.2.1 吸湿率 取颗粒2 g，置于已干燥恒重的扁形称量瓶中，轻摇使颗粒均匀分布于称量瓶底部，敞口放入盛有NaCl过饱和溶液的干燥器内，干燥器密封，48 h后取出称定质量，计算吸湿率[7]，公式为吸湿率=[(吸湿后颗粒质量-吸湿前颗粒质量)/吸湿前颗粒质量]×100%。

2.2.2.2 成型率 取过1号筛而不过5号筛的合格颗粒，称定质量，计算成型率[8]，公式为成型率=(合格颗粒质量/颗粒总质量)×100%。

2.2.2.3 溶化率 取颗粒1 g，置于已干燥至恒重的50 mL离心管中，加入100 ℃沸水20 mL，搅拌并振摇5 min，离心，弃去上清液，残渣置于80 ℃下烘干至恒重，称定质量，计算溶化率[9]，公式为溶化率=(溶化的颗粒质量/颗粒总质量)×100%。

2.2.2.4 休止角 将3个漏斗串联固定在铁架台上，铁架台置于坐标纸上，保持最底端的漏斗口距坐标纸1 cm(H)，将颗粒沿壁倒入最顶端漏斗口中，待坐标纸上颗粒椎体顶端触及最底端漏斗下沿时停止，记录颗粒锥体底部直径为2R，计算休止角α[10]，公式为α=arctanH/R。

2.2.2.5 堆密度 将颗粒放入已干燥恒重的量筒中，反复振荡，记录体积，称定颗粒质量，计算堆密度[10]，公式为堆密度=颗粒质量/颗粒体积。

2.2.3 辅料筛选 对预胶化淀粉、麦芽糊精、甘露醇、微晶纤维素进行筛选，设定浸膏粉与辅料比例为1∶1，润湿剂(95%乙醇)用量0.35倍，按“2.2.1”项下方法制备颗粒，测定其吸湿率、成型率、溶化率，结果见表6。由此可知，预胶化淀粉成型率及麦芽糊精吸湿率、溶化率明显优于其他辅料，综合考虑，选用预胶化淀粉与麦芽糊精作为辅料[11]。

2.2.4 均匀设计 选择浸膏粉与辅料比例(A)、95%乙醇用量(B)、预胶化淀粉与麦芽糊精比例(C)作为影响因素，吸湿率(X1)、成型率(X2)、溶化率(X3)、休止角(X4)、堆密度(X5)作为评价指标，G1-熵权法确定权重系数，计算综合评分(Y)，采用均匀设计优化成型工艺[12-13]，因素水平见表7。

表7 成型工艺因素水平

表8 评价指标权重值

表9 均匀设计结果

2.2.6 工艺验证 按“2.2.5”项下优化的成型工艺制备3批颗粒，测定吸湿率、成型率、溶化率、休止角、堆密度，计算综合评分，结果见表10。由此可知，颗粒平均综合评分高于表9最高值93.715 2分，而且各指标RSD均<3.00%，表明该工艺稳定可行。

表10 成型工艺验证试验结果(n=3)

2.2.7 临界相对湿度测定 在棕色干燥器内配置7种盐(CH3COOK、MgCl2、K2CO3、NaBr、NaCl、KCl、K2SO4)的过饱和溶液，放置48 h。取颗粒2 g，置于已干燥恒重的扁形称量瓶中，轻摇使其均匀分布在称量瓶底部，敞口放在盛有不同盐过饱和溶液的干燥器中，放置48 h后称定质量，计算吸湿率[16]，结果见表11。以相对湿度为横坐标(X)，吸湿率为纵坐标(Y)绘制曲线，在曲线前后拐点处做切线，结果见图2，可知前、后拐点处切线方程分别为Y=0.073 4X+0.955 4、Y=0.502 6X-26.447 4，两切线交点所对应的横坐标为临界相对湿度(CRH)，其数值为63.85%。

表11 颗粒吸湿率测定结果

图2 颗粒吸湿曲线

3 讨论

中药治疗过程中“多靶点、多途径”的特点与所含的多种化学成分密不可分，因此评价指标的选择是中药提取工艺研究中十分重要的环节[17]。本研究所选的7种评价指标，不仅包含毛蕊异黄酮葡萄糖苷、松果菊苷、毛蕊花糖苷等对前列腺增生有明确治疗作用的单体成分[18]，又有总黄酮、总多糖等有效部位，可较全面地评价所选工艺参数的优劣。

因扶正治癃方中含熟地、肉苁蓉两味中药，故黏性大，吸湿性大，流动性差，在制成颗粒时需加入合适的润湿剂与辅料。预实验发现，当润湿剂乙醇浓度为95%时，颗粒成型性好。微晶纤维素和甘露醇作为填充剂时，所得颗粒松散、硬度不够。麦芽糊精和预胶化淀粉价格低廉、口感滑腻、具有流动性好，溶解性能好，不易吸潮等特点。两者结合使用可以很好的降低颗粒吸湿性，提高成型性与溶化性。

权重系数是中药多指标评价时必须考虑的问题之一。目前应用较多的是主观赋权法[19]，这类方法虽在一定程度上体现了中药复方的配伍规律，但主观性较强，常忽略实际样本的数据信息特点。近年来，信息熵理论加权法、G1-熵权法、AHP-CRITIC混合加权法等在工艺优化中逐渐得到广泛应用。该类方法简单易行、结果精确，避免了人为确定权重的随意性和不确定性，使实验结果更加可靠、科学。