辛伐他汀对肋骨骨折大鼠外周血T细胞亚型及炎症因子表达的影响Δ

李 建，温伯泉，郭士兵，王 岩

(1.开滦总医院林西医院麻醉科，河北 唐山 063100；2.唐山市中心医院麻醉科，河北 唐山 063000)

骨折创伤部位局部免疫细胞会增加并分泌白细胞介素(IL)17等细胞因子，参与骨组织形成，增加成骨细胞的活性，促进骨折部位愈合[1]。辛伐他汀的主要功能是抑制内源性胆固醇的合成，从而起到降低血脂的作用，在临床上主要被用于治疗高胆固醇血症和冠心病等，其也可以显著促进骨质疏松引起的骨折愈合[2]。本研究将通过不同剂量辛伐他汀干预大鼠肋骨骨折模型，探讨不同剂量辛伐他汀对大鼠骨折后不同时间免疫细胞及炎症因子释放的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)；4 ℃冰箱(合肥美菱股份有限公司)；SC-3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；pectraMax190型酶标仪(美国MD公司)；一次性使用微量采血管(20 μl，泰州市宇杰医疗器械有限公司)。

1.1.2 药品与试剂：乙醚购自天津市申泰化学试剂有限公司；辛伐他汀(S6196，5 mg)购于美国Sigma公司；Rat 肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(RAB0479)和Rat IL-17 ELISA试剂盒(RAB1906)购于美国Sigma公司；PE Anti-CD8(ab95526，50 μl)和APC Anti-CD4(ab256309，100 μl)购于美国Abcam公司。

1.1.3 实验动物：8～10周龄雄性SPF级SD大鼠，由北京维通利华实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肋骨骨折模型的建立：60只8～10周龄雄性SD大鼠于SPF级鼠房饲养，室温调节在(25±2)℃，相对湿度为40%～65%，12 h/12 h昼夜交替照明，自由摄取食物和饮用水。适应性饲养1周后，将大鼠随机分为三组，即对照组和辛伐他汀低、高剂量组(5、10 mg/kg)，每组20只[3]。以10%水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉，大鼠取俯卧位，常规剪毛后碘伏消毒，铺无菌巾，沿肋骨走形作斜行切口(长约1 cm)切开背部皮肤，肌肉，暴露第6肋骨，锐性剥离肋间肌肉，距脊柱约1.5 cm处用眼科剪剪断，复位，分层缝合。第2周和第4周，小动物X光活体成像系统下拍摄X线片观察骨折对位及愈合情况[4]。以二甲基亚砜溶解稀释辛伐他汀，按以下方式给药，高剂量组大鼠灌胃10 mg/(kg·d)，1日1次，给药4周；低剂量组大鼠灌胃5 mg/(kg·d)，1日1次，给药4周；对照组大鼠给于等量二甲基亚砜，1日1次，给药4周。每周大鼠眼眶采血，备用。

1.2.2 流式细胞技术检测大鼠血液CD4、CD8抗体：大鼠眼眶取血后，红细胞裂解血液，1 500 r/min，离心半径13.5 cm，离心5 min，磷酸缓冲液(PBS)重悬外周血单个核细胞，将配好的CD4、CD8抗体加入106细胞中，4 ℃避光孵育30 min，以2 ml PBS清洗后，采用流式细胞术检测细胞亚型及细胞比例[5]。

1.2.3 ELISA法检测外周血细胞因子：采用ELISA检测试剂盒检测血清样本中TNF-α、IL-17含量，每组设置3个复孔，操作步骤严格按照说明书进行[6]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同剂量辛伐他汀干预对大鼠肋骨骨折的影响

三组大鼠在给药2周后骨折线均较明显，骨折处骨痂明显，包绕于骨折区域，骨皮质不连续；与对照组相比，辛伐他汀低剂量组、高剂量组大鼠均形成骨痂。给药4周后，辛伐他汀低剂量组和高剂量组大鼠骨折部位高密度影像，骨皮质较连续，骨折线几乎不可见，残留骨痂少，生长较连续，见图1。

图1 不同剂量辛伐他汀干预对大鼠肋骨骨折的影响Fig 1 Effects of different doses of simvastatin on rib fracture in rats

2.2 不同剂量辛伐他汀干预对肋骨骨折大鼠T细胞的影响

给药第1、2周，辛伐他汀高剂量组、低剂量组大鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞含量与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)，并且具有CD4+、CD8+T淋巴细胞含量升高的趋势；给药第3、4周，辛伐他汀高剂量组、低剂量组大鼠CD4+、CD8+T淋巴细胞含量低于对照组，但差异均无统计学意义(P>0.05)；辛伐他汀低剂量组与高剂量组大鼠间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同剂量辛伐他汀干预对肋骨骨折大鼠T淋巴细胞含量的影响Tab 1 Effects of different doses of simvastatin on T cells in rats with rib fracture

2.3 不同剂量辛伐他汀干预对肋骨骨折大鼠CD4+/CD8+比值的影响

与对照组相比，辛伐他汀高剂量组、低剂量组大鼠的CD4+/CD8+比值在治疗第1、2周显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 不同剂量辛伐他汀干预对肋骨骨折大鼠CD4+/CD8+T细胞比例的影响Tab 2 Effects of different doses of simvastatin on the ratio of CD4+/CD8+ T cells in rats with rib fracture

2.4 不同剂量辛伐他汀干预对肋骨骨折大鼠外周血TNF-α、IL-17水平的影响

相对于对照组，辛伐他汀高剂量组、低剂量组大鼠在给药第1、2周的TNF-α、IL-17水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.001)，高剂量组、低剂量组大鼠之间的差异无统计学意义(P>0.05)；辛伐他汀高剂量组和低剂量组在治疗第3周和第4周的TNF-α、IL-17水平高于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，高剂量组大鼠的TNF-α、IL-17水平低于低剂量组，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 辛伐他汀干预对肋骨骨折大鼠外周血TNF-α、IL-17水平的影响Tab 3 Effects of different doses of simvastatin on the levels of TNF-α and IL-17 in peripheral blood of rats

3 讨论

近年来，随着生活水平的提高，肥胖、糖尿病等慢性疾病引发骨结构破坏的比例逐渐升高，其结果会导致骨质疏松症等疾病，约有10%～20%由此发生的骨折会出现延期愈合或不愈合的现象，严重影响患者的健康。外力创伤致骨折后，骨组织断端间会发生组织修复的过程，最终在成骨细胞与破骨细胞的动态平衡以及周围组织细胞的营养支持下恢复正常的结构和生理学功能。骨折愈合的机制较为复杂，涉及的细胞和反应阶段较多，骨组织愈合时间较长，且各阶段参与的细胞与因子释放均有所不同。骨免疫学说于21世纪初提出，通过阐明骨骼系统和免疫系统之间的信号分子，转录因子以及受体的交叉机制，来描述免疫与骨骼的复杂关系。骨免疫学包括骨和免疫系统交叉调节的所有方面，包括各种细胞类型、信号通路、细胞因子和趋化因子，包括在稳态和致病条件下骨细胞对免疫细胞的主动调节，这些都是研究如何控制骨和免疫相关疾病的核心部分[7-10]。研究结果表明，在实验鼠的骨折部位免疫细胞会增加并产生IL-17，增加参与骨组织形成的造骨细胞的活性，从而促进骨折部位愈合[11]。干扰实验鼠骨折部位形成免疫细胞及其生成的IL-17细胞因子，结果发现，实验鼠的骨折愈合出现延迟。

辛伐他汀为羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶抑制剂，除了作为调节血脂药调节胆固醇以外，还具有抗炎和免疫调节作用，并通过提高成骨细胞活性和抑制破骨细胞的激活，影响骨的合成与代谢[12]。本研究通过不同剂量辛伐他汀干预大鼠骨折模型，探讨辛伐他汀对骨折后大鼠获得性免疫细胞的影响，X光活体成像结果表明，辛伐他汀对骨折愈合有促进作用，同时对早期CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均具有显著的提高效果。提示辛伐他汀可增强骨折早期机体免疫状态，促进机体应对外界感染做出及时响应，有助于骨折的恢复。CD4+、CD8+T淋巴细胞占人T淋巴细胞的1%～2%，但在一些疾病中其比例会发生显著变化。CD4+/CD8+的比值为免疫调节的一项指标，在人类中正常值约1.4～2.0，若其比值>2.0或<1.4，表明细胞免疫功能紊乱，因此，CD4+/CD8+比值能够直接反映人体免疫功能[13-16]。本研究结果表明，辛伐他汀给药后第1、2周，辛伐他汀低剂量组和高剂量组大鼠均出现CD4+、CD8+T淋巴细胞含量显著增加的现象，同时CD4+/CD8+比值显著升高，而辛伐他汀低剂量组与高剂量组之间的差异无统计学意义(P>0.05)，提示辛伐他汀有助于骨折早期免疫系统状态的平衡，可提高整体免疫系统功能。

TNF主要由活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞及T淋巴细胞产生，骨折后外周血TNF-α水平会发生显著变化，在骨折前期会显著升高，而在骨折后期开始降低，其机制与刺激成骨细胞与破骨细胞平衡，激活免疫系统功能，增强组织修复密切相关[10]。本研究通过检测大鼠外周血TNF-α水平发现，辛伐他汀干预会显著提高早期外周血TNF-α水平，并且在低剂量时即可发生显著的变化，同时在干预后期，其水平依然高于对照组，提示辛伐他汀可以促进骨折后免疫系统的激活以及早期骨组织修复应答，进而有利于骨折创伤的恢复。

IL-17由CD4+T淋巴细胞分泌，是炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎症细胞因子来放大炎症反应，能够诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞合成分泌IL-6、IL-8、粒细胞集落刺激因子和前列腺素E2，促进细胞间黏附分子的表达；IL-17与受体结合后，可通过促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径和核因子κB途径发挥其生物学作用[17-18]。Th17细胞能够分泌产生IL-17 A、IL-17F、IL-6以及TNF-α等，上述细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞。Th17细胞产生的IL-17能有效介导组织炎症反应,并且在骨丢失中发挥重要作用[19-20]。本研究结果表明，与对照组相比，给药后第1、2周辛伐他汀低剂量组和高剂量组大鼠均出现IL-17水平显著升高的现象，提示辛伐他汀在早期炎症反应过程中，发挥了促进炎症因子释放的作用，可增强炎症因子诱导的细胞信号转导，有利于组织修复和抗感染能力，促进早期骨骼修复。

综上所述，辛伐他汀对大鼠骨折早期免疫细胞平衡产生影响，并增加骨折早期免疫细胞因子TNF-α和IL-17释放，促进早期骨骼愈合。