超高效液相色谱 -串联质谱法测定金红片中川楝素的含量

李 伟，郝晶晶，梅升辉，赵志刚

(1.北京卫生职业学院药学系，北京 101101；2.首都医科大学附属北京天坛医院药学部，北京 100070)

金红片是由川楝子、延胡索(醋制)、红花八角叶和木香组成的复方制剂，可用于慢性浅表性胃炎、肝胃不和证等[1-2]。目前金红片的检测方法中仅对延胡索乙素进行控制，而川楝子作为君药却没有任何体现。川楝子的主要成分为川楝素，具有丰富的药理作用[3-4]，如抑制胃癌细胞增殖作用[5-7]等，与金红片的药效非常相关。对于川楝素的定量分析可使用高效液相色谱法[8-12]或液-质联用法[13-20]，但均存在前处理复杂、分离度差和分析时间长等问题。目前，液相色谱-质谱联用方法用于金红片中川楝素的检测未见文献报道。本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱方法，此方法前处理简单，分离时间短，灵敏度高，为金红片的质量标准升级提供了技术基础。

1 材料

1.1 仪器

Exion LC AD型高效液相色谱仪(美国AB Sciex 公司)；QTRAP 6500+型质谱仪(美国AB Sciex 公司)；Mettler NewClassic MS型电子天平(瑞士Mettler公司)。

1.2 药品与试剂

金红片(批号为180401、190303及190401，购自金鹤年堂大药房，均为市售产品)；川楝素对照品(批号为111842-201804，纯度为96.9%，购自中国食品药品检定研究院)；甲醇、乙腈和蒸馏水(均为色谱纯，购自Fisher公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱-质谱条件

2.1.1 色谱条件：使用Exion LC AD超高效液相色谱仪，QTRAP 6500+质谱仪。采用Phenomenex Kinetex XB-C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流动相为水(A)和乙腈(B)，流速为0.5 ml/min，柱温为40 ℃，进样量为10 μl。梯度洗脱程序：0 min，70%A；0～3 min，70%～50%A；3～3.5 min，50%～5%A；3.5～4.0 min，5%～5%A；4.0～4.1 min，5%～70%A；4.1～5.0 min，70%～70%A。

2.1.2 质谱条件：质谱离子化方式为电喷雾离子源负离子模式(ESI-)，川楝素在多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式下的定量离子对为m/z 573.3→531.3，碰撞电压为-26 V，去簇电压为-95 V，质谱图见图1。

图1 川楝素的质谱图Fig 1 Mass spectrum of toosendanin

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备：取川楝素对照品适量精密称定，加入甲醇制成每1 ml含1 mg的对照品储备液，用70%甲醇水溶液稀释成质量浓度分别为200、20、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.02及0.01 μg/L的工作液(S10—S1)。按“2.1”项下条件检测，结果见图2(A)。

2.2.2 供试品溶液的制备：取样品片5片，精密称定，研细，精密称取样品粉末10 mg，置于10 ml容量瓶中，加入甲醇振摇2 min，超声20 min萃取，以12 000 r/min离心10 min后，取上清液加入70%甲醇水溶液稀释10倍即得。按“2.1”项下条件检测，结果见图2(B)。

2.2.3 阴性对照溶液的制备：用70%甲醇水溶液作为阴性对照溶液。

2.3 线性范围考察与定量限测定

取川楝素对照品工作液S1—S10各10 μl，分别进样，川楝素有2个互变异构体，出现2个峰，与文献报道一致[13-17]。以川楝素对照品工作液的浓度为横坐标，2个峰面积之和为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。检测限为0.005 μg/L，定量限为0.01 μg/L。川楝素在0.01～200 μg/L范围内线性关系良好。回归方程为Y=318.746 94X+680.963 67(r=0.997 9)。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液；图中峰1、2 为川楝素异构体(toosendanin isomer)A.control solution;B.test solution;C.negative control solution;peaks 1 and 2 in the figure indicates toosendanin isomer图2 超高效液相色谱图Fig 2 Ultra-high performance liquid chromatography diagram

2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下的对照品溶液S5，连续进样10次，计算峰面积的RSD为1.39%，表明仪器精密度良好，见表1。

表1 精密度试验结果Tab 1 Results of precision test

2.5 重复性试验

取供试品金红片(批号为180401)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量。结果显示，川楝素含量的平均值为61.35 μg/g，RSD为0.99%，表明重复性良好，见表2。

表2 重复性试验结果Tab 2 Results of repeatability test

2.6 加样回收率试验

取已知含量的金红片样品，精密称定，3份1组，分别精密加入低、中及高3个浓度(相当于川楝素含有量80%、100%及120%)的川楝素对照品溶液适量，按照“2.2.2”项下方法操作，测定结果见表3，表明样品提取效率稳定。

表3 加样回收率试验结果Tab 3 Results of recovery test

2.7 稳定性试验

取同一批金红片(批号为190303)供试品溶液，室温(25 ℃)放置，分别于0、2、4、6、8、12、24及48 h按上述条件测定，测得川楝素峰面积的RSD(n=7)为4.3%，表明供试品溶液在室温放置48 h内稳定。

2.8 样品含量测定

取3个批次的金红片，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量，结果见表4。

表4 金红片中川楝素的含量测定结果Tab 4 Content determination of toosendanin in Jinhong tablets

3 讨论

3.1 质谱条件的优化

根据川楝素的结构，选择ESI-模式采集，定量离子对为m/z 573.3→531.3(母离子为川楝素丢失1个氢原子，子离子为川楝素的酯键出现α断裂后，丢失CH3—C≡+O碎片[17])。检测方式为MRM模式。经过优化，选择气帘气172 kPa，离子化温度450 ℃，喷雾电压-4 500 V，离子源气体GS1 207 kPa、GS2 414 kPa，碰撞电压-26 V，去簇电压-95 V。

3.2 色谱方法的优化

流动相选择方面，分别尝试了甲醇和乙腈作为有机相，发现甲醇作为流动相时，川楝素的2个异构体分离效果较差；而乙腈作为流动相时，峰形较好，且异构体能达到基线分离。在水相选择中，分别尝试了水[8]和0.01%甲酸溶液[14-20]，对比发现，甲酸溶液作为水相信号下降了约1倍，这可能是在负离子检测模式下，需要化合物减去氢，而甲酸是氢的供体，因此加入甲酸后信号出现了下降。最终本研究选择乙腈和水作为流动相进行梯度洗脱，缩短了检测时间，提高了灵敏度，达到了2个异构体峰基线分离的效果。

综上所述，本研究建立了金红片中川楝素含量的超高效液相色谱-串联质谱测定方法，线性范围宽，线性关系好，精密度高，分析时间短，前处理简单，回收率、精密度和稳定性都能满足定量分析的要求，可作为金红片质量控制标准的参考。