酶响应型菊酯/二氧化硅纳米粒的制备及性质

余 圣， 方夏伦， 邹爱华

（华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237）

在农业生产领域，农药被广泛用于控制杂草、昆虫以及植物疾病，而在农药的喷施过程中仅有30%的药液可作用于靶标生物，其余的农药会进入河流、土壤和大气中。为达到理想的杀虫效果通常会滥用农药，对生态环境与非靶标生物造成严重危害[1]。传统农药配方中药物的释放主要是通过被动扩散等方式进行，农药在达到靶标前会提前释放，从而使农药的利用率降低[2]。因此，近年来发展的新型靶标绿色农药配方逐渐受到关注。当受到pH[3]、光[4]、温度[5]、氧化还原[6]等生物或非生物刺激时，刺激响应型农药配方可使得农药智能释放，具有优良的农药靶标控释特性。Ding 等[7]将聚乙二醇与光响应型邻硝基苄基偶联，并接枝二氯苯氧乙酸(2,4-D)，合成了两亲性聚合物−农药偶联物，该偶联物能在水溶液中自组装成胶束，在无光照条件下几乎没有药物释放，但在模拟太阳光条件下，胶束内药物的累积释放速率逐渐增加，在8 h 可达到99.6%的释放率。Sheng 等[8]以腙键诱导水凝胶法制备阿维菌素（AVHG）水凝胶用于负载阿维菌素，该体系具有温度和pH 双重控制释放特性。Yi 等[9]将硫代癸烷通过二硫键接枝到介孔二氧化硅表面以调控水杨酸(SA)的释放，并以癸烷为封堵剂，防止药物提前释放，体外释放实验结果表明，在谷胱甘肽（GSH）存在下，SA 的释放速率明显高于无GSH 存在的实验组。虽然上述载体都能实现活性成分的控制释放，但大部分工作都集中于对外源性刺激的研究，针对内源性刺激的研究较少。酶是生物消化吸收的关键因素，在咀嚼性口器幼虫的唾液腺和中肠中均存在α-淀粉酶[10-11]，因此，本文拟利用α-淀粉酶对环糊精的水解作用制备酶响应型载体。

本文使用自模板法制备氨基化中空介孔二氧化硅(HMSN) 用于负载脂溶性高效氯氟氰菊酯(LC)，以羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)为封堵剂，通过酰胺化反应将LC 接枝到HMSN 表面，制备α-淀粉酶(α-Amylase)响应型CM-β-CD/LC/HMSN 纳米粒。通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、N2吸附-脱附测试、X 射线衍射(XRD)、动态光散射(DLS) 及热重分析(TGA)等测试手段对空白CM-β-CD/HMSN及载药CM-β-CD/LC/HMSN 纳米粒的结构进行表征。通过薄膜透析法研究α-淀粉酶对CM-β-CD/LC/HMSN 纳米粒药物释放行为的影响，进一步通过浸虫法与浸叶法评价纳米粒对黏虫幼虫的生物活性。

1 实验部分

1.1 原料与试剂

正硅酸乙酯（TEOS）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、甲酰胺、羧甲基-β-环糊精钠盐、甲苯、无水乙醇、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-[3-（二甲基氨基）丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC），以上试剂均为分析纯，均购于上海泰坦科技股份有限公司；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），分析纯，购于Sigma-Aldrich；氨水，分析纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LC，工业品，购于江苏扬农化工股份有限公司；润湿分散剂（SP-SC3260），工业品，市购。实验中所用到的水均为实验室自制的重蒸水。

1.2 测试与表征

傅里叶变换红外光谱(FT-IR)：采用美国Nicolet公司的Nicolet iS10 型FT-IR 光谱仪，使用KBr 压片法分别测定中空介孔二氧化硅(HMS)、LC/HMSN、CM-β-CD/HMSN 样品在4 000～400 cm−1波长范围内的红外光谱。

比表面积和孔径测试：采用美国Micromeritics公司生产的ASAP-2020 型全自动比表面及孔隙度分析仪分别对HMSN、CM-β-CD/HMSN 样品进行比表面积和孔径的测试。

X 射线衍射（XRD）图谱：采用Rigaku 公司的D/max-2550 型粉末XRD 仪分别对HMSN、CM-β-CD/HMSN 样品进行物象分析，CuKα（λ=0.154 nm）作为辐射源，测试范围为0°～10°。

Zeta 电位分析：采用德国Beekman Coulter 公司的纳米粒度仪及Zeta 电位分析仪分别对HMS、HMSN、CM-β-CD/HMSN、LC/HMSN 、CM-β-CD/LC/HMSN样品的Zeta 电位进行测定。

热重分析：采用德国耐驰公司的STA 449 F3 热重分析仪分别对HMSN、LC/HMSN、CM-β-CD/LC/HMSN 样品的热稳定性进行测试，介质为空气，升温速率10 ℃/min，升温范围20～800 ℃。

1.3 实验步骤

1.3.1 CM-β-CD/LC/HMSN 纳 米 粒 的 制 备 采 用 自模板法[12]合成HMS：分别量取30 mL 无水乙醇和5 mL重蒸水加入到100 mL 的圆底烧瓶中，加入0.8 mL氨水调节pH 至碱性，量取3 mL TEOS 加入到上述溶液中，45 ℃下搅拌40 min 后离心、洗涤、干燥，得到二氧化硅球。称取300 mg 二氧化硅球作为中空模板，加入450 mg CTAB 并溶解于乙醇溶液(乙醇与水的体积比2∶1) 中，再加入2 mL 氨水调节pH 至碱性，室温下搅拌12 h 后离心、洗涤、干燥、刻蚀，得到HMS。称取100 mg HMS 于30 mL甲苯中，加入100 μL 硅烷偶联剂APTES，于120 ℃油浴中氮气回流搅拌6 h 后离心、洗涤、干燥，得到HMSN[13]。称取一定量的LC 加入到DMF 溶剂中，使其全部溶解，再加入一定量的HMSN，在室温下搅拌24 h，然后将反应液离心、洗涤、干燥，得到LC/HMSN。改变LC 与HMSN 的质量比进行筛选，得到最佳药载比。通过紫外-可见分光光度计得到HMSN 内载入的LC 质量（min），并根据式（1）计算LC 的载药量WLC：

其中，md表示LC/HMSN 固体粉末的总质量。

将20 mg 羧甲基-β-环糊精钠盐加入到磷酸盐缓冲液(PBS)（10 mmol/L，pH 7.4）中，加入19.2 mg EDC和11.5 mg NHS，室温下搅拌活化1 h，称取20 mg LC/HMSN 加入到PBS 缓冲溶液中，并在室温下搅拌24 h 后离心、洗涤、干燥，得到的样品即为CM-β-CD/LC/HMSN[14]。

按照上述方法制备空白载体CM-β-CD/HMSN纳米粒。

1.3.2 体外释放研究 采用透析法研究LC/HMSN和CM-β-CD/LC/HMSN 的缓释行为。考虑到药物溶解性以及实际应用时的溶剂成分等因素，选用DMF与水的混合溶液(DMF 与水的体积比6∶4) 作为缓释介质。将等量的载药纳米粒分散在5 mL 缓释介质中，向其中一份溶液（CM-β-CD/LC/HMSN）中加入适量的α-淀粉酶，将装有样品的透析袋（截留分子量为8～14 kDa）分别浸入45 mL 释放介质中，置于恒温振荡器中避光振荡，保持温度为25 ℃，转速为100 r/min。在预设好的时间点依次取出3 mL 释放介质，并补充等量新鲜介质。将取出的释放介质通过紫外-可见分光光度计测定样品在270 nm 波长处的紫外吸收强度，绘制紫外吸收强度-质量浓度标准曲线，得到不同时刻药物的释放率，计算公式如式（2）所示。

其中：ρn为每个取样点缓释介质的质量浓度（mg/L）；ρi为第i次所取样品的质量浓度（mg/L）；V0和Vi分别为缓释介质的总体积和每次相隔一定时间取出的待测样品体积（L）。

1.3.3 生物活性实验 为了验证酶响应型菊酯/二氧化硅纳米粒的酶控制释放效果，分别采用浸虫法和浸叶法进行杀虫活性实验。

称取40 mg CM-β-CD/LC/HMSN，加入质量分数为25%的润湿分散剂至总质量为1 g，搅拌均匀，再加入99 g 质量分数为0.05% 的吐温−80 并配制成LC 质量浓度为100 mg/L 的母液，然后依次稀释至所需的实际药物质量浓度（40、10、4、1、0.4、0.1 mg/L和0.04 mg/L）。为进行对比，配制空白载体CM-β-CD/HMSN 与原药LC 分散液作为对照实验组。

(1) 浸虫法：将3 龄黏虫幼虫浸入药液中10 s，置于放有玉米叶的培养皿中，并盖严。

(2) 浸叶法：将玉米叶浸入药液中10 s，晾干后，置于培养皿中，然后接入3 龄黏虫幼虫，并盖严。

以上实验环境均为光照培养箱，温度25 ℃，光照条件为14 h（光亮）/10 h（黑暗），湿度≥50%。加药后3 d 计算黏虫的死亡率。每组做3 次平行实验。

2 结果与讨论

2.1 酶响应型菊酯/二氧化硅纳米粒物理化学性质表征

HMSN 的透射电镜图如图1 所示，所制备的HMSN 粒径为302.43 nm。通过酰胺化反应在HMSN表面修饰CM-β-CD 获得酶响应型二氧化硅纳米粒CM-β-CD/HMSN。利用FT-IR、XRD 以及N2吸附-脱附测试验证CM-β-CD/HMSN 合成的可行性，并对其结构进行表征。

图1 HMSN 的透射电镜图Fig. 1 TEM image of HMSN

图2 是HMS、HMSN、CM-β-CD/HMSN 的红外光谱图。由图2 可见，HMS 的红外谱图在波数1 079 cm−1和800 cm−1处的吸收峰应归于HMS 中Si—O—Si键的伸缩振动和弯曲振动，而3 450 cm−1和1 628 cm−1处的吸收峰为Si—OH 的伸缩振动和弯曲振动。HMS表面氨基化后，1 530 cm−1处出现的新峰为N—H 键的伸缩振动，表明HMS 表面成功修饰了氨基[13]。进一 步 在HMSN 表 面 接 枝CM-β−CD 后，在1 630、1 423 cm−1处出现了新峰，分别为酰胺化反应后形成的C＝O 键的振动峰和C—N 键的振动峰[14]，由此可认为CM-β-CD 成功地接枝在HMSN 表面上。

图2 HMS、HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的红外光谱图Fig. 2 FT-IR spectra of HMS, HMSN and CM-β-CD/HMSN

N2物理吸附-脱附测试常用来分析介孔材料的介孔参数，如比表面积、孔径等。图3（a）所示为HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的吸附等温曲线，从图中可见HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的吸附等温曲线都是典型的IV 型曲线[15-16]，但是CM-β-CD/HMSN 的吸附等温曲线在相对压力（p/p0）为0.1～0.4 处不存在尖锐的线型。图3（b）为HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的孔径分布图，可见HMSN 的孔径大小主要为2.45 nm，但接枝CM-β-CD 后，CM-β-CD/HMSN 的孔径分布变宽且无尖峰存在，主要是由于CM-β-CD 接枝到HMSN 表面后，均匀的介孔孔道被封堵。根据BET 比表面积测试法和BJH 孔体积和孔径测试法模型拟合结果，得到HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的比表面积（SBET）、孔体积（Vt）和孔径分布（Dp），如表1 所示。由表1 可以看出，HMSN 的SBET为473.28 m2/g，Vt为0.30 cm3/g，Dp为2.45 nm，以上数据可说明HMSN有较大的孔径与比表面积，为后续负载LC 提供理论基础。而CM-β-CD/HMSN 的SBET明显下降到51.68 m2/g，Vt下降到0.08 cm3/g，Dp值难以测得。这一结果进一步证实CM-β-CD 在HMSN 表面成功接枝，CM-β-CD堵住HMSN 的介孔孔道，导致比表面积和孔体积都有明显的下降。

图3 HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的N2 吸附-脱附等温线(a)和孔径分布(b)Fig. 3 N2 Adsorption-desorption isotherm (a) and pore size distribution (b) of HMSN and CM-β-CD/HMSN

表1 HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的孔结构参数Table 1 Pore structure parameters of HMSN and CM-β-CD/HMSN

XRD 小角度衍射实验可判断纳米介孔材料的介孔有序性。图4 所示为HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的XRD 图谱。由图4 可见，HMSN 在2°～3°之间存在一个衍射峰，表明HMSN 具有有序介孔结构。CM-β-CD/HMSN 在2°～3°之间仍有一个强度较弱的衍射峰，说明接枝CM-β-CD 后HMSN 的基本结构并没有被破坏[17-19]。但是CM-β-CD/HMSN 衍射峰强度小于HMSN 的衍射峰强度，这是由于CD 是一种环状低聚糖，当接枝到HMSN 表面后，可堵住HMSN 表面的介孔，致使样品介孔有序程度下降，因此CM-β-CD/HMSN 在2°～3°间的衍射峰强度减弱[19]。

图4 HMSN 和CM-β-CD/HMSN 的XRD 图谱Fig. 4 XRD patterns of HMSN and CM-β-CD/HMSN

FT-IR、N2物理吸附-脱附测试及XRD 的实验结果均表明HMSN 及CM-β-CD/HMSN 制备的可行性。

以LC 为模型药物，根据图5所示制备酶响应型菊酯/二氧化硅纳米粒CM-β-CD/LC/HMSN。首先改变LC 与HMSN 的质量比（药载比），以载药量为参考筛选LC/HMSN 纳米粒配方，发现当药物与载体的质量比为30∶1 时载药量较好（24.98%）。进一步在LC/HMSN 纳米粒表面通过酰胺化反应修饰CM-β-CD，制备得到CM-β-CD/LC/HMSN。

图5 CM-β-CD/LC/HMSN 的制备过程示意图Fig. 5 Schematic diagram of preparation process of CM-β-CD/LC/HMSN

图6 所示为样品HMS、HMSN、CM-β-CD/HMSN 、LC/HMSN 和CM-β-CD/LC/HMSN 的Zeta 电位结果。由图可见，HMS 的Zeta 电位为−18.0 mV，而HMSN的Zeta 电位为+28.0 mV，这是由于HMS 表面氨基功能化后，氨基的存在使其电位由负变为正。在HMSN表面接枝CM-β-CD 后，CM-β-CD/HMSN 的Zeta 电位变为−13.2 mV，是由于环糊精表面羟基和羧基的存在使其发生正转为负的变化[12]。LC 药物分子带有微弱的负电荷，负载LC 后的HMSN 的电位为+10.1 mV，较HMSN 有所降低，证明药物的成功负载。CM-β-CD/LC/HMSN 的电位变为−7.7 mV，表明LC/HMSN 表面成功接枝了CM-β-CD 分子。

图6 HMS、HMSN、LC/HMSN、CM-β-CD/HMSN 和CMβ-CD/LC/HMSN 的Zeta 电位（图中的误差条代表标准差(n = 3)）Fig. 6 Zeta potential of HMS, HMSN, LC/HMSN, CM-β-CD/HMSN and CM-β-CD/LC/HMSN (Error bars in the graph represent standard deviations (n = 3))

采用热重分析仪对样品在加热条件下的失重行为进行研究，考察HMSN 对LC 的载药量及CM-β-CD 在LC/HMSN 表面的修饰。如图7 所示，HMSN的失重主要是由于载体中水的挥发以及表面氨基的解离，总失重率约为21.99%。相对于HMSN，LC/HMSN的失重进一步增大，失重率为46.31%，由此可推测LC 的负载量为24.32%，这一结果与通过紫外-可见分光光度计测得的载药量(24.98%)几乎一致。CMβ-CD/LC/HMSN 的总失重率达到了50.88%，相比于LC/HMSN，失重率增加4.57%，这主要是由于表面接枝的CM-β-CD 解离的原因[20]。TGA 结果进一步证明了CM-β-CD/LC/HMSN 纳米粒的成功制备。

图7 HMSN、LC/HMSN 和CM-β-CD/LC/HMSN 的TGA 曲线Fig. 7 TGA curves of HMSN、LC/HMSN and CM-β-CD/LC/HMSN

2.2 体外释放行为

样品的体外释放结果如图8 所示。在缓释介质中，LC/HMSN 的释放曲线表现为明显的缓慢释放行为，48 h 后释放趋于平衡，释放量为85%。当HMSN表面接枝CM-β-CD 后，LC 的释放变得更为缓慢，12 h后趋于平衡，72 h 内的释放量仅为20%，这是因为CMβ-CD 和HMSN 表面的氨基发生酰胺化反应后，环糊精分子堵住HMSN 纳米粒的介孔，一定程度上抑制了HMSN 内部孔道及空腔里的药物释放，降低了LC 的释放速率。很有意思的是在缓释溶剂中加入α-淀粉酶后，受到α-淀粉酶的影响，HMSN 表面接枝的CD 逐渐分解脱落，介孔孔道口被打开[20-21]，使得LC 加速释放，在36 h 后，体系中LC 的释放趋于平衡，72 h 内的释放量为55%。因此，CM-β-CD/LC/HMSN表现出良好的酶响应型控释行为。

图8 LC/HMSN 和CM-β-CD/LC/HMSN 在DMF 与 水 混合溶液(体积比6∶4)中的释放曲线（图中的误差条代表标准差(n = 3)）Fig. 8 Release curves of LC/HMSN and CM-β-CD/LC/HMSN in DMF aqueous solution (V(DMF):V(H2O)=6∶4) (Error bars in the graph represent standard deviations (n = 3))

2.3 生物活性评价

LC 具有触杀和胃毒两种作用方式，浸虫法研究的是LC 的触杀作用[22]，而浸叶法研究触杀和胃毒相结合的作用效果[23]。CM-β-CD/HMSN 纳米粒对黏虫没有杀虫活性，表明CM-β-CD/HMSN 有着良好的生物相容特性。

图9(a)和9(b)分别是由浸叶法实验与浸虫法实验得到的黏虫致死率与LC 质量浓度关系图。由图可知，随着LC 质量浓度的增加，黏虫的致死率逐渐增大，且在相同质量浓度下，浸叶法得到的致死率均约为浸虫法得到的致死率的2 倍，说明在使用浸叶法时有更多的LC 释放出来，发挥杀虫作用。但是CMβ-CD/LC/HMSN 在两种方法下的致死率均低于LC 原药，这可能与LC 在CM-β-CD/LC/HMSN 纳米粒中的缓慢释放有关。

图9 CM-β-CD/LC/HMSN 与LC 在浸叶法(a)与浸虫法(b)下对黏虫的致死率（图中的误差条代表标准差(n = 3)）Fig. 9 Mortality of CM-β-CD/LC/HMSN and LC for Mythimna separata in leaf dipping method (a) and larva dipping method (b) (Error bars in the graph represent standard deviations (n = 3))

根据图9 的实验结果，采用DPS 数据处理软件，计算得到各药剂能够引起虫子一半死亡时LC 的质量浓度（ρ(LC50)）及95% 置信限等数据，结果如表2所示，其中毒性回归方程中X为lgρ(LC50)，Y为死亡几率。由表2 可知，采用浸虫法时CM/β-CD/LC/HMSN 纳米粒的ρ(LC50)=135.24 mg/L，LC 主要通过触杀作用杀虫；采用浸叶法时CM/β-CD/LC/HMSN纳米粒的ρ(LC50)=20.12 mg/L，明显低于浸虫法。这是由于当采用浸叶法时，LC 不仅能发挥触杀作用，并且当虫子将叶片吃下去后，虫子体内的α-淀粉酶将CM-β-CD 分解，促使LC 释放出来，通过胃毒作用杀虫[20-21,24]。上述结果与体外缓释实验结果一致，说明CM-β-CD/LC/HMSN 具有较好的杀虫活性以及酶响应控释特性。

表2 采用浸叶法与浸虫法时CM-β-CD/LC/HMSN 与LC 对黏虫的杀虫活性Table 2 Insecticidal activity of CM-β-CD/LC/HMSN and LC to Mythimna separata using larva dipping method and leaf dipping method,respectively

3 结 论

(1) 采用自模板法制备得到中空介孔二氧化硅纳米粒，将其表面氨基化，并进一步在其表面修饰CM-β-CD 作为封堵剂，制备得到α-淀粉酶响应型二氧化硅纳米粒CM-β-CD/HMSN。红外光谱、N2吸附-脱附测试和X 射线衍射结果均表明了CM-β-CD/HMSN 的成功合成。

(2) 以LC 为模型药物，筛选获得α-淀粉酶响应型菊酯/二氧化硅纳米粒CM-β-CD/LC-HMSN。热重分析和Zeta电位测试结果表明CM-β-CD/LC/HMSN制备成功，其载药量高达24.98%，解决了LC 脂溶性的问题。

(3) 体外药物释放实验表明CM-β-CD/LC/HMSN纳米粒具有良好的酶响应控释特性。生物活性实验中，采用浸叶法时CM-β-CD/LC/HMSN 纳米粒对黏虫幼虫的杀虫活性要优于浸虫法，进一步证明了纳米粒的酶响应型控释行为与杀虫活性。因此，CM-β-CD/LC-HMSN 纳米粒可使农药的释放更加智能化，为针对靶标实现农药控释及增加农药使用效率提供新思路。