HPLC对头孢克肟干混悬剂的含量测定研究

杨 佳

济源市妇幼保健院(河南 济源 459000)

头孢克肟为口服头孢类抗菌药物,对细菌产生的β-内酰胺酶有高度稳定性。该药物杀菌力较强且抗菌谱广,具有高疗效及组织渗透性、有效浓度持续时间较长、用量小、不良反应发生率低等特点[1-2]。体外研究表明[3],高出成人剂量100多倍时不会使细胞染色体突变及损伤。故该药安全性较高,可用于儿童抗感染治疗,且为较好抗感染治疗转换药。由于头孢克肟制剂内有较多讲解产物,受到其余辅料感染,其含量测定不适宜用紫外法[4]。为此,本研究探讨了HPLC对头孢克肟干混悬剂的含量测定,报道如下。

1 仪器与方法

1.1仪器与试药 仪器:高效液相色谱仪(安捷伦,型号:1100型)、紫外检测器(型号:G1314A型)、进样器(77251I型)、电子天平(AE-104N型)。

试药:头孢克肟对照品(中国药品生物制品检定所,批号:130503-200502)、乙腈、蒸馏水、头孢克肟干混悬剂(哈尔滨凯程制药有限公司,国药准字:H20060266,规格:1g:50mg)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Inertsil ODS-SP C18柱,设置150×4.6mm,5μm；流动相氢氧化四丁胺-乙腈,25ml的10%氢氧化四丁胺溶液稀释至1000ml,pH用磷酸调节为7.0,乙腈为3∶1；流速为1.2ml/min；柱温为40℃；检测波长为254nm；进样量为20μL。理论板数不低于3000[5]。

取系统适用性溶液、对照品与供试品溶液、适量阴性样品溶液分别注入液相色谱仪中,于条件色谱下测定并记录色谱图。

2.2溶液制备 对照品溶液:精密称取适量头孢克肟对照品,加入磷酸缓冲液制成每毫升含0.2mg头孢克肟的对照品溶液。

供试品溶液:取10袋供试品称定,研细后称取4.4mg放置于100ml容量瓶内,加入60ml磷酸缓冲液,超声处理30min,放冷至室温,再加入缓冲液稀释至刻度,摇匀过滤。

系统适应性溶液:精密称取50mg供试品置于50ml容量瓶内,向其加入缓冲液进行溶解,再加水30ml沸水浴45min,放冷至室温后,加入流动相稀释至刻度,摇匀。

阴性样品溶液:根据处方称量辅料,按照供试品溶液方法配置阴性样品溶液[6]。

降解溶液:①酸破坏:取50mg供试品放于50ml容量瓶,加5ml甲醇使其溶解,加入1mol/L盐酸溶液5ml静置1h,用同浓度的NaOH溶液与之中和,流动相稀释至刻度,摇匀。②碱破坏:取50mg供试品置于50ml容量瓶内,5ml甲醇溶解,加0.1mol/L NaOH溶液3ml静置10min,倒入同浓度HCl溶液中和,流动相稀释至刻度,摇匀。③氧化破坏:取50mg供试品放置在50ml容量瓶内,5ml甲醇溶解,加5ml的3%过氧化氢溶液静置1h,流动相稀释至刻度,摇匀。④水解破坏:取50mg供试品于50ml容量瓶内,甲醇溶解,加30ml水,置于沸水浴内45min,放冷后用流动相稀释至刻度,摇匀。⑤加热破坏:取50mg供试品,于105℃下加热3h,放冷后倒入50ml容量瓶,甲醇溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀。⑥光照破坏:取50mg供试品,于254nm紫外光照射下进行24h照射,后置于50ml容量瓶内,甲醇溶解,用流动相稀释至刻度,摇匀[7]。

2.3方法学考察 阴性干扰:按处方比例制备无头孢克肟空白样品,按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液,依次进样。色谱图见图1。

图1

线性关系考察:精密量取0.1182g头孢克肟对照品放于100ml容量瓶内,缓冲液溶解稀释至刻度,量取0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml置于50ml容量瓶内,加缓冲液稀释至刻度摇匀,吸取以上溶液20μL分别注入色谱仪中,根据色谱条件进样,记录色谱图。以头孢克肟进样量作为横坐标,峰面积为纵坐标,计算其回归方程。结果显示,头孢克肟进样量在0.4～2.4μg与峰面积线性关系较好[8-9]。

精密度试验:取对照品溶液在色谱条件下重复5次进样,记录峰面积。结果峰面积的RSD=0.04%,说明仪器精密度良好。

稳定性试验:取同一供试品溶液分别在0、2、4、6、8h进样。结果峰面积RSD=0.65%,提示供试品溶液在8h内较稳定。

重复性试验:取同一供试品,分别配置5份供试品溶液,进样。结果含量RSD=0.45%,说明方法重现性良好。

加样回收试验:取0.26g已知含量样品,精密称定。精密加入适量对照品,按供试品溶液方式制备溶液,用流动相稀释至刻度,进样记录峰面积,测量含量并计算回收率[10-11]。结果见表1。

表1 加样回收试验结果

2.4样品含量测定 分别取10份样品,按供试品溶液方式制备20μL溶液放置色谱仪内,记录色谱图,根据外标法计算样品中头孢克肟含量,与2015版药典中头孢克肟含量测定方法测定结果比较[12]。结果批号为091001、091002、091003、091004、091005、091006、091007、091008、091009、091010样品中含量分别为44.8、44.6、43.9、43.6、44.2、43.8、43.9、44.5、44.4mg/g。

3 讨论

头孢克肟为常用的头孢类抗菌药物,对大部分革兰阴性、阳性均有较强抗菌性,能抑制多数菌种,临床多用于泌尿系统、呼吸道感染等治疗,不良反应较少。《中国药典》中关于头孢克肟及制剂的含量测定采用四丁基氢氧化铵溶液作为其流动相[13]。由于头孢克肟分子结构中有弱酸性和弱碱性基团,故可调节溶液pH改变解离状态,进而调节在反向色谱上保留时间。本研究使用固定0.025mol/L磷酸盐缓冲液浓度,10%乙腈,十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂,流动相pH改为3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2,考察系统适用性溶液内不同pH流动相对头孢克肟保留时间、分离度及前后相邻峰、杂质峰分离度影响[14]。结果表明pH增加,头孢克肟分离度、理论塔板数减小,由于酸性可能过大,C18基团易断裂,故本试验采用磷酸盐缓冲液pH3.6作为流动相,此时头孢克肟有合适保留时间、理论板数,其峰形较理想[15]。固定流动相pH3.6,改变乙腈为5%、10%、15%,结果显示,乙腈为5%,头孢克肟峰保留时间长；乙腈为15%时,头孢克肟峰与其E异构体峰难以分离；当乙腈为10%,头孢克肟峰及其异构体峰保留时间较适中,分离度也较好,故本实验选择10%含量的乙腈。

综上所述,本研究中色谱柱、流动相比例、流速、主峰峰形均良好,分离效果较佳；操作简便,结果准确、可靠,可用于头孢克肟干混悬剂含量测定。