P53信号通路在苦参碱诱导人结肠癌SW-480细胞凋亡的作用机制

刘 斌 刘 晔

1.靖边县中医医院(陕西 榆林 718500);2.靖边县人民医院(陕西 榆林 718500)

结肠癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,据文献报道结肠癌发病率在全球居第3位,且呈逐年增高趋势[1]。P53起初被认为是致癌基因,随着研究的深入,其抑癌功能陆续报道[2]。P53参与肿瘤的周期调控、细胞凋亡及抑制血管生成等过程[3]。中药苦参碱(Matrine)除了具有抗心律失常、抗炎、抗病毒等作用外,还具有较强的抗肿瘤作用[4],但是苦参碱治疗结肠癌相关研究报道较少,本研究通过使用苦参碱干预人结肠SW-480细胞,探究苦参碱对结肠癌细胞凋亡的影响及其分子机制,为后续深入研究提供理论基础。

1 材料

一抗P53/E-Cad/Bax/β-actin购自proteintech公司,二抗购自中山金桥公司。蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司,CCK-8细胞活力检测试剂盒购自北京全式金生物公司。Western Blot曝光仪购自AZURE公司,酶标仪购自bio-rad公司。

2 方法

2.1CCK-8实验测定苦参碱对SW-480细胞的影响 将SW-480细胞接种于细胞培养皿内培养,等到细胞生长状态良好时,消化细胞接后种于96孔板内,生长一段时间后加入含苦参碱细胞培养液,继续在5%CO2细胞培养箱内培养,弃掉原培养液加入不含血清的细胞培养液,同时加入CCK-8检测试剂,开始测定吸光度值并记录实验结果。

2.2Western blot检测P53蛋白表达变化 将SW-480细胞接种于细胞培养皿内培养,等到细胞生长状态良好时,加入含苦参碱的细胞培养,培养一段时间后收取细胞并提取蛋白。配置SDS-PAGE蛋白胶,加样电泳结束后,开始转膜,条件为300mA 转模30～50min,待封闭完成后分别放入一抗(P53/E-Cad/Bax/β-actin)中室温孵2～4h,洗膜后放入二抗(1∶4000)中室温孵育1～2h,洗膜后加入发光液采集图像,保存数据。

2.3统计分析 使用SPSS 19.0分析试验数据,使用GraphPad Prism5.0作图。原始数据符合正态分布,同时满足方差齐性,则使用t检验或方差分析,P<0.05提示差异有统计学意义。

3 结果

3.1苦参碱对结肠癌细胞增殖力的影响 使用不同浓度含苦参碱培养基干预SW-480细胞,结果如图1所示,当苦参碱浓度为3mg/mL时,能够较好的抑制SW-480细胞的增殖。

图1 苦参碱干预SW-480细胞活力测定

3.2Western blot 检测P53蛋白表达水平 结果如图2所示,使用2/3/4mg/mL的苦参碱干预细胞后,提取蛋白通过Western blot 检测P53、Bax、E-Cad蛋白表达,结果MA组较CON组P53、Bax、E-Cad蛋白表达量明显增高(P<0.05);MA2组较MA3组P53蛋白表达量明显增高(P<0.05),MA4组较MA3组BAX/E-Cad蛋白表达量明显降低(P<0.05)。

图2 苦参碱干预SW-480 P53蛋白表达水平CON:对照组,MA:苦参碱干预组

4 讨论

近年来随着人们生活水平提高以及生活方式的改变,结肠癌的发病率及致死率逐年增高,严重危险到人类健康[5]。起初P53基因被认为是一种致癌基因,随着研究的深入P53抑癌功能逐渐被揭示[6]。P53基因是人类肿瘤相关性最高的基因,P53基因广泛分布于核仁、线粒体等结构中,参与细胞周期调控、细胞凋亡及维持基因组稳定等过程[7]。P53在不同组织中诱导细胞凋亡的机制不尽相同,P53通常在Bcl-2家族的作用下通过线粒体调控凋亡。Bcl-2家族主要由抑制细胞凋亡蛋白和促进细胞凋亡蛋白组成,Bax基因是人体最主要的凋亡基因,是极重要的促细胞凋亡(Apoptosis)基因之一[8]。研究发现 P53 作为转录因子在转录水平激活Bax的表达,进而引起细胞衰老,抑制肿瘤的增殖、促进肿瘤细胞凋亡[9]。单良[10]等研究报道明根皮素可通过激活ERK、P38通路增加P53、BAX蛋白表达水平,诱导人卵巢癌CAOV-3细胞凋亡,从而发挥抗癌作用。张蕾[11]等研究报道淫羊藿苷可显著抑制小鼠CT26细胞结肠癌肝转移瘤的生长,其机制可能与上调p53和Bax蛋白,下调Bcl-2蛋白有关。

苦参碱(Matrine)是临床上一种常用中药,研究表明苦参碱可抑制肿瘤细胞的增殖,临床上苦参碱对白血病、肝癌和胃癌都有较好的疗效,同时由于其毒副作用小,故有可能发展成为很好的抗肿瘤药物[12]。张伟等[13]研究了不同浓度苦参碱对人急性淋巴细胞白血病侵袭转移的抑制作用,结果发现苦参碱能全面抑制白血病细胞的粘附能力、运动能力和侵袭能力。E-Cad通过相连的链蛋白使相邻的癌细胞相连,维持细胞间的粘附,当E-Cad表达降低,使其粘附性变小,发生侵袭和转移[14]。杨鹏等研究发现苦参碱能够诱导SW480细胞凋亡,该药理作用可能与苦参碱对Akt信号通路的抑制有关[15]。李金州等研究表明苦参碱可抑制结肠癌SW480和SW480/M5细胞的增殖,克隆形成和迁移侵袭能力,其机制可能与抑制AKT/GSK3β/β-catenin信号通路有关[16]。

本研究使用中药苦参碱干预人结肠细胞SW-480,通过CCK-8、Western blot技术检测细胞增殖力及P53变化,以及肿瘤侵袭转移因子E-Cad的变化情况,研究发现苦参碱能够较好的抑制人结肠细胞SW-480的增殖力,使用苦参碱干预后,P53蛋白及其下游基因Bax表达量MA组较CON组升高,E-Cad表达量升高。

综上所述,苦参碱可能通降低结肠癌细胞的侵袭和转移能力,诱导结肠癌细胞凋亡,达到抗肿瘤作用。