铁皮石斛DoTIFY基因家族全基因组鉴定及在原球茎发育过程中的表达

胡 睿，郭建秀，郭小强，陈凤颖，王万军

(西南交通大学 生命科学与工程学院，成都610031)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)，是国家中药材保护品种，多年生附生草本兰科石斛属植物，主要分布于中国云南、贵州、四川等地。药用价值很高，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等功效。且铁皮石斛的全基因组的测序工作已经完成，有利于在分子层面上进行进一步的探索[1]。铁皮石斛的种子小、无胚乳，导致天然环境下难栽培，需要研究铁皮石斛的种胚萌发调控机制来更好地繁育铁皮石斛。形成原球茎是兰科植物特有重新启动细胞分裂的发育模式，对兰科植物的种胚萌发调控起重要作用，因此需要探究影响原球茎形成的分子机制。

据报道，TIFY基因能够调控植物的生长发育过程。TIFY是一类植物特异性转录因子家族。最初被报告为锌指蛋白ZIM(At4g24470)，后因高度保守的TIFY结构域而被划分为TIFY家族。TIFY结构域包含约28个氨基酸，核心基序为TIF[F/Y]XG。TIFY家族分为4个亚族：TIFY、JAZ、PPD和ZML[2]。除均包含高度保守的TIFY结构域外，JAZ亚族包含Jas域，也称为CCT_2域[3]，PPD亚族包含截短的Jas域和PPD域，ZML亚族包含CCT域和ZML域[4]。

植物发育阶段会激活JAZ蛋白的表达。在番茄中，SlJAZ2是从营养生长向生殖生长过渡的重要调节剂[5]。OsTIFY3/OsJAZ1可以通过与水稻中的OsMYC2和OsCOI1b相互作用来调节花的发育和根的伸长，而OsJAZ1核心部分的取代或缺失会影响花和根发育过程中JA信号的特异性和敏感性。另一个水稻JAZ基因OsTIFY11b/OsJAZ10可以通过增强茎中碳水化合物的积累来增加粒大小[6]。AtTIFY4a(PPD1)和AtTIFY4b(PPD2)参与叶生长的协调，调节叶片的大小并限制叶片的弯曲度。豆科直系同源基因PPD BIG SEEDS1调节细胞的增殖和植物器官大小[7]。同时TIFY基因对非生物胁迫有反应，研究表明，TIFY基因通过SCFCOI1的 26S蛋白酶体途径降解JA，消除JA响应基因的抑制。

近年来，对JAZ亚族研究较多，且大多数通过拟南芥和水稻进行了功能验证[7-9]。但TIFY基因家族对铁皮石斛原球茎发育过程中的调控机制还不甚清楚，且铁皮石斛中该基因家族的全基因组信息还有待分析。鉴于此，作者分析铁皮石斛的TIFY家族基因的系统发育关系以及蛋白质和基因结构，为进一步了解TIFY基因在铁皮石斛原球茎发育过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)植株及种子为实验室自育、自繁，成熟果荚采摘后经无菌处理，将其种子散铺于1/2MS固体培养基表面、放置在 (26±1)℃的无菌培养室中诱导种子萌发形成原球茎，并在 LEICAM165C 体视显微镜下分别收集处于种胚活化并突破种皮期(seed embryo activation and breakthrough testa,P1)、原球茎形成期(protocorm,P2)、原分生组织形成期(promeristem,P3)、顶端分生组织形成期(SAM,P4)、椭球型原球茎时期(spheroidicity protocorm,P5)、叶原基维管系统形成期(leaf primordium and vascular system,P6)、根端分生组织形成期(RAM,P7)[8]等7个时期的原球茎材料，经液氮速冻后置于-80 ℃冷冻冰箱中冻存待用。

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛DoTIFY基因家族的鉴定

利用SWISS-PROT数据库收集拟南芥TIFY蛋白序列(AtTIFY)和水稻蛋白序列(OsTIFY)；在中草药组学数据库 (http://202.203.187.112/herbalplant/)中获取铁皮石斛基因组序列。

利用AtTIFY和OsTIFY序列local BLASTP在GenBank数据库中搜索铁皮石斛TIFY序列；通过隐马尔科夫模型(HMM)筛选TIFY家族序列，其中包括TIFY域(Pfam:PF06200)、CCT域(Pfam:PF06203)、Jas域(也称CCT2域)(Pfam:PF09425)和GATA结构域(Pfam:PF00320)(e<0.01)[9]；合并结果，去冗余，利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)鉴定保守结构域，去除不含TIFY域的蛋白序列，获得铁皮石斛TIFY家族成员(DoTIFYs)序列。利用ExPASy工具分析铁皮石斛TIFY蛋白家族的分子质量(MW)、等电点(pI)、总平均亲疏水性(GRAVY)等；使用Softberry的ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)和Cell-PLoc 2.0的Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf)预测TIFY基因家族蛋白的亚细胞定位。

1.2.2 保守基序分布、基因结构分析和系统发育分析

利用MEME (http://meme-suite.org/)对DoTIFYs蛋白序列进行保守基序鉴定[10]；根据基因组gff3格式的原始注释文件，使用TBtools对DoTIFYs的CDS进行注释[11]；利用PlantCARE对DoTIFYs基因启动子顺式作用元件进行分析；MEGA 7.0的MUSCLE程序对铁皮石斛、拟南芥、水稻、陆地棉和向日葵TIFY家族蛋白进行多序列比对，并构建最大似然(ML)树(bootstrap值设置为1 000次)[12]。

1.2.3 铁皮石斛转录组RNA-seq数据分析

收集处于P1～P5时期的铁皮石斛原球茎、并使用Trizol法提取总RNA，每个时期设置3个重复，共15个样品。用Nanodrop检测总RNA的纯度(OD260/280,OD260/230)，使用 Agilent 2100 检测总RNA 的 RIN 值、28S/18S、图谱基线、5S峰；使用电泳排除RNA样品的基因组污染。将符合要求的总RNA进行Illumina HiSeq TM 4000转录组测序。

1.2.4 铁皮石斛实时定量RT-PCR分析

用植物RNA提取试剂盒(成都百菲特)提取铁皮石斛原球茎各时期的总RNA。琼脂糖凝胶电泳检测合格后，酶标仪测定总RNA含量与OD260/280。以总RNA为模板，使用逆转录酶Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-,TaKaRa)体系和引物Oligo(dT)18进行逆转录反应。设计DoTIFY基因的qRT-PCR引物(表1)，测序验证其cDNA模板无误后在LightCycler 96 (Roche)上进行定量分析；以DoACTIN和DoGAPDH为参考基因，3次重复；用2-ΔΔCT方法计算DoTIFY的相对表达量[13]。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers of qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛TIFY基因的全基因组鉴定

从铁皮石斛基因组中共鉴定出20个DoTIFY家族基因(表2)。在构建进化树时发现有一个DoTIFY(Dendrobium_GLEAN_10066219)与拟南芥、陆地棉和向日葵的PPD蛋白聚为一类，但不含有截短的Jas域，因此根据基因组注释向后寻找了5 000 bp，经过Softberry的fgenesh-m和单子叶植物(大麦、水稻、玉米)的HMM模型比对，将结果通过NCBI-CDD进行保守域的鉴定找到了后面的截短的Jas域，矫正了铁皮石斛的TIFY家族的基因注释。

表2 在铁皮石斛基因组中鉴定出的DoTIFY家族基因Table 2 DoTIFY family genes identified in D.officinale

结果表明，TIFY家族成员的氨基酸序列长度从142 aa (DoJAZ11)到517 aa (DoJAZ13)，理论分子质量从13.79 ku (DoJAZ6)到57.00 ku (DoJAZ13)，pI从5.3 (DoPPD1)到9.54 (DoTIFY1)。所有TIFY蛋白都定位在细胞核中。

2.2 铁皮石斛TIFY基因家族的系统发育特征

在GenBank数据库中获得拟南芥、水稻、陆地棉和向日葵的共68条TIFY蛋白序列。与DoTIFY进行系统发育分析(MEGA7.0)。结果(图1)显示，JAZ亚家族最多，铁皮石斛的TIFY蛋白成员在进化亲缘性上更偏向于同为单子叶植物的水稻。PPD蛋白构成独特的进化枝，包括拟南芥(AtPPD1和AtPPD2)，陆地棉(GaPPD1和GaPPD2)，向日葵(HaPPD1和HaPPD2)和仅一个铁皮石斛(DoPPD1)。

图1 不同物种TIFY蛋白系统发育分析Figure 1 The phylogenetic tree of TIFY protein sequences from different plants

2.3 铁皮石斛TIFY基因家族的保守基序和保守结构域分析

蛋白质序列分析表明，所有铁皮石斛TIFY蛋白在TIFYXG的氨基酸水平上普遍具有保守性。DoJAZ和DoZML的保守序列是SLXRF(L/F,E/Q)KRKXRX5PY和SLXRFR(E/Q)KRKXRX7Y，DoPPD包含一个截短的Jas基序，缺少保守的P、Y残基。

通过MEME在线工具分析铁皮石斛TIFY蛋白保守域，鉴定出10个保守基序。其中，motif1和3、motif 1和6、motif 1和7组成TIFY域，大部分的TIFY域由motif 1和3组成。motif 2为Jas域(图2)。另外，motif 4被注释为ZnF_GATA结构域，基序2和3组成CCT域。

(a)基于进化关系的DoTIFY的保守域(不同的基序用不同的颜色表示，每种蛋白质中基序的长度按比例显示)；(b)TIFY域的保守基序;(c)Jas域的保守基序;(d)CCT域的保守基序。图2 DoTIFY的保守基序分析Figure 2 Conserved motif analysis of DoTIFY

2.4 铁皮石斛TIFY基因家族的基因结构分析

通过绘制基因结构和蛋白质保守结构域图，在DoTIFY基因上游调控区(2 kb)预测启动子元件(TATA框、CAAT框)，见图3。发现蛋白质的保守结构域和外显子在基因序列上的位置并不完全一致。DoTIFY基因家族成员包含1～8个外显子，每个亚科的外显子数量各不相同。

图3 DoTIFY的基因结构和蛋白质保守域分析Figure 3 Analysis of DoTIFY gene structure and protein conserved domain

2.5 铁皮石斛TIFY基因家族的顺式作用元件分析

基因5′上游区域的顺式作用元件中有TF的结合位点，负责转录调控[14]。提取DoTIFY基因上游2 kb预测调控元件(图4)。参考经过实验验证的25种植物(拟南芥、水稻、番茄等)中启动子区域的顺式作用元件，预测到铁皮石斛TIFY基因家族存在大量的顺式作用元件，主要有与植物激素、与生长发育、与昼夜节律光响应、与缺氧厌氧诱导、与转录因子结合位点以及与胁迫反应相关。每个TIFY基因家族的成员都能在多个不同位点预测到光响应(chs-CMA1a、LAMP-element、Sp1等)和与胁迫反应(DRE、MYB、MYC等)相关的顺式作用元件，其中与茉莉酸、脱落酸、赤霉素和水杨酸相关元件(TGACG-motif、CGTCA-motif、ABR等)和与生长发育相关的顺式作用元件(TGA-element、CAT-box等)，虽然不是在每个TIFY基因家族的成员中都能预测到，但仍然大量存在。该结果表明，DoTIFY基因在铁皮石斛的生长发育过程以及对植物激素和非生物胁迫的响应中具有重要作用。

图4 DoTIFY的顺式作用元件分析Figure 4 Analysis of DoTIFY cis-acting element

2.6 铁皮石斛TIFY基因家族在原球茎发育过程中表达分析

对铁皮石解5个不同时期、3个生物学重复共15个样品的原球茎进行Illumina RNA-seq测序，共得到106.81 Gb Clean Data，Q30 达到 91.20%。重复样本间相关系数r>0.9。组装后得到21 572个完整ORF序列、并完成27 107个新转录本的功能注释。

根据转录组数据，DoTIFY基因家族的BLAST结果和转录组RNA-seq数据一致，绘制了铁皮石解原球茎不同时期发育过程中DoTIFY的表达谱(图5)。结果显示，在铁皮石解原球茎发育过程中11个DoJAZ基因差异表达。在原球茎发育过程中，DoJAZ5和DoJAZ6在P1～P5时期显示先明显上调再明显下调最终缓慢上调。DoJAZ3、DoJAZ9和DoJAZ10在P1～P2时期显示低表达明显上调，在P4～P6时期高表达缓慢上调。DoJAZ8和DoJAZ15在P1～P3时期显示低表达缓慢上调，P4～P6时期低表达下调。而DoJAZ7、DoJAZ14、DoJAZ2和DoJAZ4在P1～P5时期显示低表达上调，表明这些基因可能在铁皮石解原球茎发育中起作用。

图5 转录组中差异表达的11个DoTIFYFigure 5 Eleven DoTIFYs differentially expressed in the RNA-seq

为深入了解DoTIFY基因在各种组织中的表达谱，选定4个DoTIFY基因(DoJAZ3、DoJAZ8、DoJAZ5和DoJAZ6)在铁皮石解原球茎发育的7个不同时期进行了qRT-PCR分析。结果发现，这4种DoTIFY基因在7个不同时期的表达模式与转录组数据大致相同(图6)。

P1～P7 分别代表铁皮石斛种胚活化期，原球茎形成，原分生组织形成，顶端分生组织形成，椭球形原球茎时期、叶原基维管系统形成和根端分生组织形成时期。图6 原球茎不同发育时期4个DoTIFY基因表达分析Figure 6 The relative expression levels of four DoTIFYs in 7 development stages of protocorm

3 讨论与结论

研究从铁皮石斛的基因组中系统地鉴定了20个DoTIFY基因。鉴定过程矫正了基因组注释中一个DoTIFY基因缺少的一段CDS，完善了注释信息。系统发育树显示TIFY蛋白以单子叶植物或双子叶植物特异性模式簇集(图1)。通过MEME进一步检测到10个保守基序分布在不同的亚族中(图2)，这可能有助于TIFY蛋白功能的多样化。研究中DoJAZ基因的外显子/内含子表现出高变异性，表明在进化过程中发生了变化，由此推测JAZ亚家族中的蛋白质可能具有不同的功能，而DoZML亚家族成员中均有7～8个外显子，在进化过程中高度保守，外显子和内含子数量的保守性与系统发育树的进化枝高度相关，这有力地支持了TIFY基因的紧密进化关系。

值得注意的是，所有的DoTIFY基因启动子中均预测到大量的不同功能的顺式作用元件(图4)，表明TIFY基因可能参与了铁皮石斛的生长和发育的许多过程。ZML家族和JAZ家族在铁皮石斛的生长和发育的过程中可能起不同的作用，而JAZ亚家族中预测到的启动子功能与系统进化的关系紧密，推测JAZ家族在进化过程中功能可能出现了分化。

DoTIFY在原球茎发育时期的转录组数据及定量表达验证，表明了不同的DoJAZ蛋白在原球茎发育时期有不同的表达模式，这证明了JAZ蛋白功能的多样性。不同的JAZ蛋白通过不同的信号传导途径或与不同的蛋白互作，影响着铁皮石斛原球茎的发育。