气相色谱质谱法测定土壤中5种苯并咪唑类的残留

郭延萍，刘永玲

(海东市生态环境局，青海 海东 810600)

0 引 言

苯并咪唑类杀菌剂，是指含有杀菌活性的咪唑环类的有机化合物，如噻菌灵、咪鲜胺等，在农业、林业等广泛应用，确保农作物、林作物等高产、稳定[1-3]。该类杀菌剂属于内吸性杀菌剂，通过与病原真菌的微管蛋白结合，抑制病菌细胞的有丝分裂，起到杀菌、抑菌的作用[4]。苯并咪唑类杀菌剂常用于水稻类纹枯病、稻瘟病，小麦类黑穗病、赤霉病，瓜果类白粉病、灰霉病等，该类杀菌剂毒性低，且能够抑制病菌生长，在杀菌剂市场占据着关键的地位，随着对具有抗菌活性的咪唑类杀菌剂和分子生物学的研究，该类杀菌剂的应用也越来越广[5]。据统计，杀菌剂在喷洒、施用时，约20%起到杀菌、抑菌作用，大部分的杀菌剂随着空气流通、雨水冲刷等进入到土壤中，对土壤环境造成不可逆的损伤，严重影响土壤微生物、动物等生态系统[6]。因此，加强对典型土壤中苯并咪唑类杀菌剂残留的监测，具有重要的意义。

常用于土壤前处理的提取方法主要有：固液萃取提取法、超声提取法和加速溶剂提取法等；净化的主要方法有：凝胶净化色谱法、QuEChERS (Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)净化法和固相萃取净化法等方法[7-9]。提取方法中，加速溶剂萃取是在高温、高压条件下进行多次提取，提取效率相对最佳；净化方法中，QuEChERS 净化法相对其他方法，具有试剂用量少，净化效果好、操作简便等优点，实验开发一种采用加速溶剂提取法将典型土壤中噻菌灵、恶咪唑、抑霉唑、咪鲜胺和氟菌唑提取出来，QuEChERS 净化法将提取液净化后，上GCMS/MS 仪定量测定的分析方法[10-15]。实验证明，此方法检测准确度高、灵敏度高，可以用于典型土壤中苯并咪唑类杀菌剂残留的监测。

1 试验部分

1.1 仪器

气相色谱仪：Agilent 7890B 型，配备自动进样器、柱温箱（美国安捷伦公司）；三重四级杆串联质谱仪：Agilent 7000D 型（美国安捷伦公司）；电子分析天平：sartorius Quintix65-1CN 型（十万分之一，德国赛多利斯公司）；加速溶剂萃取仪：Thermo ASE-300 型（美国热电公司）；高速冷冻离心机：Biobase TGL-20M 型（山东博科公司）；纯水制备仪：Milli-Q direct 16 型(美国密理博公司)。

1.2 标准物质和试剂

噻菌灵标准溶液：100µg/mL，编号为GBW(E) 082320;抑霉唑标准溶液：100µg/mL，编号为GBW(E) 082421;咪鲜胺标准溶液：100µg/mL，编号为GBW(E) 082347;氟菌唑标准溶液：100 µg/mL，编号为BWQ 8059—2016；恶咪唑标准物质：100 mg/瓶，编号为C15789000，以上均购自农业农村部环境保护科研监测所。乙腈、丙酮、正己烷、甲醇：色谱纯（上海安谱科技有限公司）；实验用水均为去离子水，纯水制备仪制备，其他试剂均为分析纯（上海化学试剂厂）。

1.3 仪器方法

1.3.1 色谱条件

气化室温度：240 ℃；色谱柱：HP-5 MS（规格：30 m×0.25 mm，0.25 µm）载气：氦气，纯度99.9999%；柱流量：1.15 mL/min；进样方式：不分流；进样量：1 µL，梯度升温。升温程序见表1。

表1 程序升温方法

1.3.2 质谱条件

离子源：ESI 源；电子轰击电压：65 eV；离子源温度：270 ℃；碰撞气：氩气，纯度99.9999%；接口温度：260 ℃；采集模式：MRM；溶剂延迟：3.6 min。

1.4 实验方法

1.4.1 标准储备溶液的配制

取恶咪唑标准物质，精密称取50 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀；再精密移取100 µL 该溶液，置10 mL 量瓶中，另取噻菌灵、抑霉唑、咪鲜胺和氟菌唑标准溶液，分别精密移取1.0 mL，置上述10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀（5种杀菌剂浓度均为：10 µg/mL）。

1.4.2 标准溶液的配制

取1.4.1 标准储备溶液，定量移取适量，分别置10 mL 量瓶中，制备含5种杀菌剂浓度依次为0.05，0.15，0.6，2.0，6.0，15.0 µg/mL 的标准系列溶液，加甲醇定容至刻度，混匀。

1.4.3 样品溶液的制备

前处理：取研细后的典型土壤样品，过60 目筛网，取过筛后的土壤样品12 g，加15 g 硅藻土，混合均匀后装填至22 mL 的萃取罐中，用乙腈-丙酮（体积比为1∶1）混合溶剂萃取。萃取方法见表2。

表2 萃取条件

净化：将上述萃取液转移至旋蒸瓶中，45 ℃旋蒸至近干，用20 mL 冰醋酸（1%）-乙腈溶液转移至50 mL 塑料离心管中，加入分散固相萃取剂硫酸镁5 g、乙酸钠2 g 盐析，涡旋1 min，高速冷冻离心6 min（转速为10000 r/min）；将离心后的上清液转移至25 mL 装有净化试剂PSA 的净化管中，涡旋1 min，高速冷冻离心6 min（转速为10000 r/min）。将离心后的净化液置试管中，氮吹至近干（温度45 ℃），残渣加甲醇1 mL，混匀即得。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的选择

土壤基质通常含有大量的无机物、有机物、水分等，如金属氧化物、硅酸盐等，成分较为复杂，常用的前处理方法有：超声提取法、索氏提取法和加速溶剂提取法等。高效的前处理方法，须将待测物尽量进行提取，且将干扰物质进行消除。超声提取法和索氏提取法，待测物提取率偏低、基质干扰较大，最终导致检测结果准确度偏低等；加速溶剂提取法是在一定的温度和压力下，反复多次的提取，待测物提取率高，且通过研究合适的提取溶剂，可以有效降低基质干扰。实验通过考察对加标浓度为0.15 µg/mL 的加标样品进行提取后提取率，比较上述3种方法对5种咪唑类杀菌剂提取率的影响，最终确定快速溶剂萃取法作为前处理方法。比较结果见表3。

表3 前处理方法比较结果

2.2 萃取条件的优化

加速溶剂萃取法，是在高温、高压的条件下将待测杀菌剂，从土壤基质中提取出来的前处理方法，影响其提取效果的因素主要是温度和压力。选择适合的温度能够保证提取溶剂在样品基质中加速流动，降低待测杀菌剂与土壤的相互作用力；同样选择合适的压力，能够保障萃取溶剂保持液态，更快地与土壤基质混合，从而提高待测杀菌剂在萃取过程的溶解能力，达到高效提取的目的。实验通过设定萃取温度（80，85，90，95，100 ℃）和萃取压力（9，9.5，10，10.5，11 MPa），考察典型土壤加标样品（加标浓度：0.15 µg/mL），在上述变化条件下的提取情况。结果，选择萃取压力为10 MPa 和95 ℃时，回收率达到最佳。

2.3 色谱柱的优化

实验考察气相色谱-质谱法常用的HP-5 MS、DB-17 MS 和Rtx-5 MS 型质谱专用柱，柱长度、膜厚和内径均一致。保持1.3 仪器方法项下色谱和质谱条件，考察上述3种不同极性色谱柱对5种待测杀菌剂分离情况和重复性的影响。结果，选择DB-17 MS 和Rtx-5 MS 型色谱柱时，5种待测杀菌剂分离效果差，且重复性实验结果较差；选择HP-5 MS色谱柱时，5种待测杀菌剂响应和分离良好，峰型尖锐，重复性结果良好。故实验选择HP-5 MS 色谱柱作为分离柱。

2.4 MRM 方法的优化

取5 µg/mL 的噻菌灵、恶咪唑、抑霉唑、咪鲜胺和氟菌唑标准溶液，按照1.3 项下的质谱条件进行一级扫描-全扫描（Q3Scan 模式），确定各农药的目标离子和保留时间。然后对目标离子进行二级扫描-产物离子扫描（Production scan 模式），得到母离子对应的碎片离子。特征离子对以及相应的碰撞能量、丰度比是质谱测试的定性依据。而定量计算时，为保证检测结果的准确度，通常以丰度较大的特征离子对的色谱峰面积作为定量依据。因此，本文选择响应较高的一个碎片离子作为定量离子，再选择2个碎片离子作为定性离子。对此方法进行碰撞电压、碰撞时间等的优化，最终确定5种农药残留的多反应监测（MRM）方法。5种农药典型色谱图见图1，质谱离子参数见表4。

图1 5种农药质量色谱图

表4 5种农药质谱参数1)

2.5 方法线性范围、曲线方程和检出限

取1.4.1 标准储备溶液，定量移取适量，分别置10 mL 量瓶中，制备含5种杀菌剂浓度依次为0.05，0.15，0.6，2.0，6.0，15.0 µg/mL 的标准系列溶液，加甲醇定容至刻度，混匀；按1.3 仪器方法项下色谱和质谱条件，分别进样以上溶液各1 µL，收集谱图。根据谱图中待测杀菌剂响应值为纵坐标（Y），对应的浓度为横坐标（X），计算标准曲线方程，以3 倍信号噪音比值计算检测限，结果如表5 所示。

表5 待测杀菌剂线性范围、曲线方程、相关系数和检出限

2.6 加标回收率考察

取空白典型土壤样品，过60 目筛网，取过筛后的土壤样品12 g，加15 g 硅藻土，混合均匀后装填至22 mL 的萃取罐中，分别加入1.4.1 标准储备溶液适量，后续按1.4.3 样品溶液项下方法处理，制备含5种待测杀菌剂浓度分别为0.02，0.15，2.0 µg/mL的加标溶液，每个加标浓度点配制3 份；再按1.3 仪器方法项下色谱和质谱条件，分别进样以上溶液各1 µL，收集谱图，根据实际检测结果和加入量计算加标回收率，结果见表6。

表6 加标回收率结果

2.7 方法重复性试验

取空白典型土壤样品，过60 目筛网，取过筛后的土壤样品12 g，加15 g 硅藻土，混合均匀后装填至22 mL 的萃取罐中，加入1.4.1 标准储备溶液适量，后续按1.4.3 样品溶液项下方法处理，制备含5种待测杀菌剂浓度为0.06 µg/mL 的加标溶液，同法平行制备6 份；再按1.3 仪器方法项下色谱和质谱条件，分别进样以上溶液各1 µL，收集谱图，计算6次检测结果的重复性RSD。结果，噻菌灵、恶咪唑、抑霉唑、咪鲜胺和氟菌唑重复性RSD 分别为3.26%、3.18%、3.75%、4.43%和2.73%，表明方法具有良好的重复性。重复性试验结果见表7。

表7 重复性试验结果

3 结束语

实验建立采用加速溶剂提取法将典型土壤中噻菌灵、恶咪唑、抑霉唑、咪鲜胺和氟菌唑提取出来，QuEChERS 净化法将提取液净化后，上GC-MS/MS仪定量测定的分析方法。实验首先对土壤的前处理方法进行了选择，确定加速溶剂萃取法作为前处理方法；考察了常用萃取溶剂的萃取效果，对色谱条件和质谱条件进行了优化，确定上述最佳条件后，对方法的线性、重复性、加标回收率等进行了考察，结果表明实验建立的方法线性范围广、加标回收率范围在85.9%～103.1%之间，5种待测杀菌剂重复性（n=6）均在5.0%范围内。实验结果证明方法具有前处理速度快、灵敏度高、检测结果准确等优点，可以用于典型土壤中苯并咪唑类杀菌剂残留的监测。