间歇运动对心梗大鼠心肌氧化应激和炎症的影响及其机制*

耿元文， 林琴琴△， 王湘怡， 李若明， 田振军

(1. 燕山大学 体育学院， 河北 秦皇岛 066004； 2. 陕西师范大学 体育学院， 西安 710062)

心肌梗死(myocardial infarction，MI) 导致心肌缺血缺氧，诱发活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生，ROS刺激炎症因子生成，炎性因子又促进ROS形成，引发缺血心肌氧化应激和炎症反应级联放大[1]。研究证实，NADPH氧化酶(NADPH oxidases，Noxs)是心血管系统中ROS的主要来源，缺血心肌Noxs表达显著增加，ROS产生增强[2]，提示，抑制来源于Noxs的ROS产生对缺血心脏保护至关重要。诸多文献表明，运动对缺血心脏保护具有良好效果。前期研究表明，高强度间歇运动较中强度有氧运动更有效改善心功能。运动可降低缺血心肌损伤，抑制氧化应激和炎症反应，增加抗氧化防御系统，提升心功能[3]，但其机制需要进一步深入研究。

沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin 1，SIRT1)是一种NAD+依赖的去乙酰化酶，参与诸多生理功能的调节，包括细胞衰老、能量平衡、氧化应激和炎症等。新近研究发现， SIRT1参与心脏保护作用，且是心血管疾病的新靶点。SIRT1上调表达可抑制缺血心脏氧化应激和炎症反应，减缓心肌缺血再灌注损伤，提升心功能[4]。最新研究证实，高强度间歇运动可显著增强糖尿病大鼠心肌SIRT1表达，改善心功能；长期持续有氧运动通过上调SIRT1表达抑制Nox表达，减轻高同型半胱氨酸血症小鼠主动脉内皮细胞氧化损伤[5]。但间歇运动是否通过SIRT1调控Nox表达参与MI心脏保护，文献报道少见。因此，本研究拟探讨间歇运动对MI大鼠心肌SIRT1和Nox表达的影响及其可能机制，为运动改善MI的病理进程及其机制探讨和相关治疗靶点筛选提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

TRIzol试剂购自Inventragtion公司，RT-PCR反转录试剂盒购自TaKaRa公司，引物有生工生物工程(上海)股份有限公司合成，兔抗多克隆抗体SIRT1和兔抗单克隆抗体Nox4均购自Abcam公司，IL-1β 抗体购于Santa公司，TNF-α一抗抗体购于GeneTex公司，BCA蛋白定量试剂盒、MDA、SOD和LDH试剂盒均购自南京建成生物有限公司，DHE活性氧荧光探针试剂盒来源于碧云天生物有限公司。

1.2 实验动物分组与MI模型制备

30只3月龄雄性SD大鼠，初始体重为180～220 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供(动物质量合格证号：陕医动证字SCXK2012-098)，分笼饲养，自由饮食水，室温20℃～29℃，湿度50%～60%。 适应性喂养1周后，随机分为假手术组(C组)、心肌梗死组(MI组)和心梗+间歇有氧运动组(ME组)，每组10只。各心梗组采用左冠状动脉前降支(LAD)结扎造模。术前腹腔注射5%戊巴比妥钠麻醉，开胸暴露心脏，结扎LAD，观察结扎远端心肌颜色变浅或变白，心电图S-T段抬高或T波倒置，即为MI模型造模成功，后逐层缝合关胸。为排除手术因素干扰，C组手术过程同上，但仅穿线不结扎LAD。

1.3 间歇有氧运动方案

运动方案参考Wisloff训练模型[6]。适应性训练1周 (10～15 m/min，30 min/d，共5 d)。正式训练起始速度10 min×10 m/min (40% ～ 50% VO2max) 热身，以7 min×25 m/min ( 85% ～ 90% VO2max) 和3 min×15 m/min ( 50% ～ 60% VO2max)交替进行大中等强度间歇运动。总时间为60 min，每周训练5 d，连续训练4 周。上述运动方案无大鼠死亡。

1.4 心电图及心脏样本处理

训练结束后次日，腹腔麻醉，采用多导生理记录仪记录心电图，数据采集完毕后，迅速摘取心脏，进行后续实验。每组随机选取大鼠心脏至于10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，制片，用于苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。选取大鼠心脏多聚甲醛固定，30%蔗糖溶液脱水后，OCT包埋进行冰冻切片。另取大鼠心脏液氮速冻后，-80℃冰箱保存待用。

1.5 Dihydroethidium(DHE)染色检测ROS

取冰冻切片，将超氧化物荧光探针DHE 负载于切片上，37℃避光孵育30 min，荧光探针DHE 在超氧化物生成处被氧化为溴化乙锭，与DNA 结合后，激发出红色荧光。用荧光显微镜观察结果，检测心脏ROS水平。

1.6 Western blot 检测蛋白表达

取心梗边缘区心肌组织50 mg，加入预冷蛋白抽提试剂500 μl，剪碎匀浆，4℃离心，取上清液，BCA蛋白定量。常规制胶、上样、电泳、转膜，5%BSA室温封闭1 h，孵育一抗Nox4(稀释浓度1∶ 2 000)、SIRT1(稀释浓度1∶600)、IL-1β(稀释浓度1∶200)、 TNF-α(稀释浓度1∶1 500)，内参GAPDH(稀释浓度1∶10 000)，4℃过夜。次日室温复温30 min后，室温孵育二抗(1∶8 000)1 h，TBST清洗，ECL发光，凝胶成像系统分析。

1.7 RT-qPCR检测基因表达

取心梗边缘区心肌组织，TRIzol提取总RNA，严格按照反转录试剂盒说明书操作步骤反转录合成cDNA, 后进行RT-qPCR反应，内参为GAPDH。引物序列如下：SIRT1上游引物：5'-CAGTTCCAG CCATCTCTGTG-3'，下游引物：5'-GCAACCTGCTCCAAGGTATC-3'；GAPDH 上游引物：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物：5'-TTTGAGGG TGCAGCGAACTT-3'。反应条件如下：95℃ 10 min，1 循环；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 循环; 72℃ 10 min。每个样品重复检测3次。利用2-△△Ct法计算相对基因表达量。

1.8 数据学处理

2 结果

2.1 间歇运动对心梗大鼠心功能的影响

各组大鼠心电图 (图1)显示：C组大鼠心电图正常，P、Q、R、S、T 各波段规范; MI 组大鼠心电图出现S-T 段抬高或T 波倒置现象，判定MI 模型造模成功;ME 组大鼠心电图趋于正常。

Fig. 1 Effects of aerobic interval training on cardiac function in rats of each group

2.2 间歇运动对心梗大鼠心肌纤维化的影响

HE染色结果显示：C组大鼠心肌细胞排列紧密，结构整齐。MI组大鼠梗死区心肌细胞排列紊乱，出现代替性纤维化，形成瘢痕组织。ME组大鼠梗死区瘢痕组织中出现红色心肌，心肌纤维化降低。表明，间歇运动可以显著改善心梗大鼠心肌形态，降低心肌纤维化 (图2)。

Fig. 2 Effects of aerobic interval training on myocardial fibrosis in rats of each group (HE ×200)

2.3 间歇运动对心梗大鼠心肌SIRT1基因和蛋白表达的影响

PCR和Western blot结果显示：与C组比较，MI组大鼠心肌SIRT1 mRNA和蛋白表达显著降低 (P<0.01)；与MI组比较，ME组大鼠心肌SIRT1 mRNA和蛋白表达显著升高 (P<0.01，图3，表1)。

Fig. 3 Effects of aerobic interval training on SIRT1 mRNA and protein expressions in rats of each group

Tab. 1 Effects of aerobic interval training on SIRT1 mRNA and protein expressions in rats of each group n=10)

2.4 间歇运动对心梗大鼠心肌Nox4蛋白表达的影响

Western blot结果显示：与C组比较，MI组大鼠心脏Nox4蛋白表达显著升高 (P<0.01)。与MI组比较，ME组大鼠心脏Nox4蛋白表达显著降低 (相对表达量C组为1，MI组为1.51±0.08，ME组为 1.08±0.09，P<0.01，图4)。

Fig. 4 Effects of aerobic interval training on NOX4 protein expression in rats of each group

2.5 间歇运动对心梗大鼠心肌ROS水平的影响

心肌组织DHE染色结果显示：与C组比较，MI组心肌组织ROS水平显著增加(P<0.01)， 呈红色荧光。与MI组比较，ME组大鼠心肌组织ROS水平显著降低 (荧光强度相对表达量C组为1，MI组为2.64±0.13，ME组为1.70±0.10，P<0.01，图5)。

Fig. 5 Effects of aerobic interval training on ROS level in rats of each group (bar =100 μm, ×200)

2.6 间歇运动对心梗大鼠心肌MDA、LDH和SOD表达的影响

结果显示：与C组比较，MI组MDA和LDH表达均显著升高(P<0.01)，SOD活性显著降低(P< 0.01)。与MI组比较，ME组MDA和LDH表达均显著降低(P<0.01)，SOD活性显著升高(P<0.01，表2)。表明心梗后大鼠心脏氧化应激增加，间歇运动降低心梗大鼠心脏氧化应激水平。

Tab. 2 Effects of aerobic interval training on MDA, LDH and SOD expressions in ratsof each group n=10)

2.7 间歇运动对心梗大鼠心肌TNF-α和IL-1β蛋白表达的影响

Western blot结果显示：与C组比较，MI组TNF-α和IL-1β蛋白表达均显著升高(P<0.01)。与MI组比较，ME组TNF-α和IL-1β蛋白表达均显著降低(P<0.01, 图6，表3) 。

Fig. 6 Effects of aerobic interval training on TNF-α and IL-1β expressions in rats of each group

Tab. 3 Effects of aerobic interval training on TNF-α and IL-1β expressions in ratsof each group n=10)

2.8 心肌SIRT1表达与Nox4和ROS的相关分析

相关分析结果显示为大鼠心肌SIRT1与Nox4蛋白呈显著负相关(r= -0.925，P<0.01)，与ROS表达呈负相关(r= -0.897，P<0.01)。表明，大鼠心肌SIRT1表达与心肌氧化应激反应密切相关。

3 讨论

MI后心室重塑是梗死心脏修复的特征表现。越来越多的动物和临床研究表明，ROS介导的MI后，心脏氧化应激在心脏重塑的发病机制中发挥重要作用，如促炎细胞因子释放、心肌细胞凋亡和纤维化等。研究证实，心梗后心肌抗氧化酶CAT，GSH和SOD活性降低，MDA和ROS水平显著升高[7]，炎症因子TNF-α和IL-1β表达增加，而过度的炎症反应加重心肌氧化应激，导致心脏受损恶化[8]。本研究结果显示，心梗大鼠心肌SOD活性显著降低，MDA、LDH表达均显著升高，ROS水平升高，炎症因子TNF-α和IL-1β表达增多，纤维化水平升高，说明心梗后氧化应激和炎症反应的交互作用严重损害心脏功能。因此，延缓心梗心肌氧化应激、抑制心肌炎症反应是保护心脏功能的有效策略。文献报道，有氧运动显著降低卵巢切除心梗大鼠和老年心梗小鼠心肌ROS的产生[9,10]，增强MI大鼠主动脉SOD活性。本研究结果显示，间歇运动显著提高心梗大鼠心肌SOD活性，降低MDA和LDH表达，减少ROS水平升高，抑制炎症因子TNF-α和IL-1β表达，减缓心肌纤维化。表明，运动可显著抑制心梗心脏氧化应激和炎症反应，但其机制值得探讨。Noxs是心血管系统中ROS的主要来源，而Nox4是其心脏中表达的主要亚型，是衰竭心脏ROS的主要来源[11]。研究发现， 抑制来源于Nox4的ROS生产可减缓缺氧导致的心肌细胞损伤。而内源性抑制Nox4可显著减轻缺血再灌注小鼠心梗面积，消除缺血再灌注损伤后ROS产生的峰值，恢复心梗后的心脏功能[12]。表明，Nox4在病理性心肌氧化应激损伤过程中具有重要作用。有氧运动抑制心梗心脏氧化应激，减少心肌炎症反应是否是通过有氧运动抑制心梗心肌Nox4的表达发挥保护心脏的作用，目前鲜有文献报道。本文研究结果显示，MI大鼠心肌Nox4蛋白表达显著增加，ROS水平显著升高；间歇运动可显著降低MI大鼠心肌Nox4蛋白表达，减少ROS产生。推测，间歇运动抑制心梗大鼠心肌Nox4-ROS通路，抑制心梗心脏氧化应激和炎症反应，提升心功能。

体内外诸多研究证明，SIRT1调节多样细胞参与心血管疾病的发病机制，其活化对心血管系统具有积极影响[13]。SIRT1激活可显著抑制MI大鼠心肌纤维化，抑制心肌缺血再灌注导致的氧化应激、炎症反应和纤维化[14]。提示，SIRT1被认为是一种强有力的药物靶标，调节SIRT1表达可能成为心血管疾病的一种新的治疗策略，而激活SIRT1的小分子被认为是心脏保护剂[13]。最新研究证实，芦丁可通过上调SIRT1表达，抑制心肌细胞氧化应激和细胞凋亡，减缓缺氧复氧损伤，保护心肌细胞[15]。最新研究证实，有氧运动可激活SIRT1信号通路，增加MI大鼠梗死边缘区SIRT1表达，减少心肌细胞凋亡和氧化应激损伤，保护心功能[16]。本研究结果显示，MI大鼠心脏梗死边缘区SIRT1 mRNA和蛋白表达显著减少，间歇运动显著增加MI大鼠梗死边缘区SIRT1蛋白和mRNA表达。说明，间歇运动上调SIRT1表达，保护心梗心功能。

研究证实， SIRT1是氧化应激的重要调节者[17]，其激活后活化eNOS、聚(ADP-核糖)聚合酶α(PARPα)、Mn-SOD和 FOXO3等因子，抑制氧化应激并阻止氧化损伤。ROS介导的氧化应激是缺血心肌损伤的主要启动因子。研究发现，SIRT1敲除小鼠可加重心肌缺血损伤，梗死面积扩大，ROS水平显著增加[18]。而内源性高表达SIRT1可显著减少ROS产生，减少心肌缺血再灌注损伤，改善心功能。表明，SIRT1在病理性心肌氧化应激发生发展过程中发挥重要作用。Kuroda等报道，Nox4依赖性的ROS是病理性心脏中氧化应激的主要来源[11]。内源性降低SIRT1活性可导致缺氧心肌细胞中Nox4过度表达增加和ROS产生[19]。而SIRT1上调表达可显著减少衰老小鼠主动脉Nox4表达，减少氧化应激和炎症，缓解主动脉内皮功能紊乱[20]。说明，SIRT1调节Nox4-ROS通路参与氧化应激调控。运动训练是心血管疾病的非药物预防策略，适度运动训练可增加SIRT1活性。研究证实，长期适度运动可显著激活MI大鼠梗死边缘区SIRT1表达，抑制心肌细胞凋亡，抑制氧化应激，保护心功能[16]。本研究结果显示，间歇运动可显著增加MI大鼠心肌SIRT1表达，减少Nox4和ROS水平，抑制心肌氧化应激和炎症因子表达。相关性分析结果表明，SIRT1表达与Nox4和ROS表达呈显著相关性。因此，SIRT1作为心脏保护因子，间歇运动激活心梗心脏SIRT1-Nox4-ROS通路，抑制MI心脏氧化应激和炎症反应，是间歇运动干预心梗心脏的重要机制之一。

综上所述，间歇运动可显著提高心梗心肌SIRT1表达，激活心梗心肌SIRT1-Nox4-ROS信号通路，抑制心梗心肌氧化应激和炎症反应，提升心功能。提示，SIRT1-Nox4-ROS信号通路在间歇运动中抑制心梗大鼠心肌氧化应激、提升心功能中发挥重要作用。