超临界流体-高效液相色谱法萃取芹菜中芹菜素

2021-10-21王高敏陈夫山

青岛科技大学学报（自然科学版） 2021年5期

王高敏，吴越，王霞，陈夫山，吉喆

(青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛 266042)

芹菜是一种具有药用价值的两年生伞形科草本植物，广泛种植于欧洲、亚洲、非洲等地，在我国也有着悠久的栽培历史[1]。芹菜中含有丰富的黄酮类化合物，这些物质既可以为芹菜提供防御机制，保护芹菜免受不同生物威胁和非生物威胁[2]，也可以充当信号素分子、植物抗毒素、排毒剂等，还具有抗菌防御、防霜冻和抗干旱的功能[3]。目前，芹菜中的黄酮类化合物已经被提取出来应用于保健食品、医疗健康等领域，且被证明具有抗氧化[4]、保护肝脏[5]、抗糖尿病[6]等功能。其中，芹菜素是芹菜中最主要的黄酮类化合物，主要以黄色素的形式存在于植物体内[7]，是黄酮类化合物中药性和生物活性最强的化合物之一，有抗癌、抗氧化、抗炎[8-9]、抗过敏、抗抑郁、保肝、抗血栓形成和抗衰老的功效[10]。

索氏提取法、热回流法和浸渍法是目前应用最广的提取方法，但是这些方法耗时长、耗能大、所用溶剂量大，限制了其应用与发展[11]；膜分离技术可以依据膜的选择透过性以及目标物分子量的差异在压力推动下将目标物质分离、纯化和浓缩[12]，但是对于分子量相接近、结构相似的目标化合物的分离效果较差。近年来，大孔树脂纯化技术[13-14]、聚酰胺树脂纯化技术[15-17]、葡萄糖凝胶树脂纯化技术[18-19]、制备型高效液相色谱技术[20-24]可以将黄酮类化合物进行准确分离，获得高纯度单体化合物，但这些提取纯化方法耗时长、效率低，不能用于大规模生产。因此，为实现芹菜的低成本高值化利用，开发一种高得率、高纯度的提取方法至关重要。

超临界流体萃取(SFE)是一种从植物中提取和纯化各种生物分子的有效技术，是传统萃取技术(如溶剂萃取法、液相蒸馏法)的有效替代方法。超临界流体是介于气体和液体之间的流体，兼有气体液体的双重性质：一方面，其溶质的传质阻力小，可以实现活性物质的快速高效分离[25]；另一方面，又具有较高的溶解能力，可在较低温度下分离难挥发、热稳定性差和相对分子质量大的物质。CO2具有无色、无味、无毒、价廉、易获取、溶解性好等又优点，是目前应用最为广泛的超临界流体之一。然而，CO2是非极性物质，对极性和强极性物质的溶解能力较差。因此，需要向SFE体系中加入极性夹带剂以提高溶质的溶解度和选择性，从而增加产品收率[26-28]。SFE利用CO2和夹带剂形成的流动相，在强度、压力、温度、固定相种类等多种因素的协同下，在结构类似物、同分异构体、对映异构体和非对映异构体混合物的分离纯化中显示出独特的优势[29-30]。由于乙醇的溶解性能较好，对植物细胞的穿透能力较强，通常采用乙醇为夹带剂提高对黄酮类弱极性物质的萃取能力。因此，本研究采用超临界CO2流体和不同浓度的乙醇夹带剂协同萃取芹菜中的芹菜素，并采用高效液相色谱法进行定量表征，以确定最佳的芹菜素萃取工艺条件。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

芹菜素标准品(98.0%，HPLC级)，购自上海阿拉丁生物科技有限公司；芹菜(Petroselinumcrispum)，系青岛平度市马家沟芹菜基地生产；无水乙醇(95%)，景明化工股份有限公司；无水乙醇(99%)，景明化工股份有限公司；乙酸(99.7%)，友和贸易股份有限公司；甲醇(100%)，友和贸易股份有限公司。

超临界萃取设备，中国台湾金属工业研究中心；高效液相色谱仪，日本Hitachi公司:Pump,L-2130,Autosampler,L-2200,UV Detector,L-2400)；超声波清洗器，FRQ-1004SHT型，杭州法兰特超声波有限公司；冷冻离心机，H5-21Kr型,湖南湘仪公司；电子天平,FA214型,上海豪晟公司。

1.2 实验条件

1.2.1 标准溶液的配制

取芹菜素标准品20,50,100,200,400 μg，用50%乙醇溶解并定容至10 mL，得到终浓度为2，5，10，20，40 μg·mL-1的标准溶液。

1.2.2 超临界萃取条件优化

取250 g马家沟芹菜粉末(颗粒大小在0.125 mm左右)，置于萃取槽中，在30 MPa、40 ℃的条件下进行萃取，每30 min从分离槽中取样一次，分离槽温度设定为50 ℃，压力设定为4.5 MPa，持续萃取4 h。本研究主要探讨夹带剂对萃取结果的影响，已有学者提出，夹带剂浓度的提高有利于非极性物质的萃取[31]，因此本实验设计一组不添加夹带剂的萃取试验(SFE CO2)，一组添加95%浓度乙醇夹带剂的萃取试验(SFE CO2+95%EtOH)，一组添加99%浓度乙醇夹带剂的萃取试验(SFE CO2+99%EtOH)。本实验采用萃取槽体积为1 L(10.5 cm×11.1 cm)的萃取设备，以50 g·min-1的CO2流速进行萃取，为避免堵塞，在萃取过程中同时从萃取槽出口端泵入流速为3.2 mL·min-1的乙醇溶液。当使用夹带剂时，以3.2 mL·min-1流速泵入乙醇与CO2在萃取槽入口端前预先混合再加热，然后进入萃取槽。

1.2.3 高效液相色谱测定芹菜素的含量

采用1.2.2的方法对芹菜素进行萃取，所得芹菜粗萃物以及芹菜素标准品用HPLC分析目标组分含量。分析方法：色谱柱：Kromasil 100-5-C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相按表1梯度进行洗脱，分析波长设定为343 nm，柱温40 ℃，流速为1 mL·min-1，进样量为20 μL。

表1 流动相洗脱程序Table 1 Mobile phase gradident elution program

1.2.4 提取率计算公式

本研究中芹菜粉原料在试验前均经过干燥预处理，故芹菜素提取率为高效液相色谱分析出芹菜素质量占原料投料量的质量分数。提取产物提取率的计算按照如下公式(1)进行。

(1)

式(1)中:F—提取率(质量分数);

m—提取出产物的质量，g；

m0—原料投料量，g。

2 结果与讨论

2.1 芹菜素标准品的色谱图及标准曲线

芹菜素标准品的HPLC色谱图保留时间为45 min。依照1.2.3节的分析条件进行测定，不同浓度芹菜素标准溶液的HPLC色谱图如图1所示。绘制标准曲线并得回归方程为Y=0.065 1X(R2=0.997 5)。

图1 芹菜素标准品不同浓度梯度芹菜素标准品HPLC色谱图Fig.1 Liquid chromatogram of apigenin standards

2.2 添加不同浓度乙醇为夹带剂的超临界萃取结果

将添加不同浓度乙醇为夹带剂进行超临界萃取得到的样品按照1.2.3的方法分析，得到的各个时间段的色谱如图2所示。从图2可以看出，3者色谱图的信号峰数量与峰形极其相似，说明在这3种条件下所得到的产物基本一致。然而，不同浓度乙醇得到的产物的紫外吸收信号强度有明显差异，这说明不同条件下超临界萃取得到的芹菜素产率不同。为了分析不同萃取条件下芹菜素的产率以及在整个萃取过程中芹菜素萃取效率的变化，本研究依据外标法对萃取出的粗萃物中的芹菜素进行定量，结果如表2所示。

图2 添加不同夹带剂浓度超临界萃取芹菜素色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of apigenin at different time periods in the process of different ethanol concentration

表2 仅使用CO2超临界萃取过程中芹菜素含量Table 2 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2

由表2可知，在仅使用CO2进行萃取时，前90 min仅有少量的芹菜素被萃取出来，HPLC几乎检测不到信号，这是因为CO2溶剂是非极性溶剂，仅使用CO2难以溶剂黄酮类等极性物质。在120 min时开始有芹菜素的信号被检出，且此时芹菜素的萃取效率最高。当萃取时间超过120 min后，芹菜素的响应值逐渐减弱，萃取得到的芹菜素质量逐渐减少。经定量分析，在仅使用CO2进行超临界萃取时，芹菜素的萃取率仅为0.000 6%。

使用CO2和99%乙醇共同萃取过程中芹菜素含量见表3。添加95%乙醇为夹带剂萃取得到的样品，其紫外吸收信号明显高于不添加乙醇的样品，这说明添加乙醇会更有效地萃取出芹菜素。在萃取过程前30 min萃取效率最高，120 min时芹菜素几乎完全被萃取出来。在使用95%浓度的乙醇为夹带剂与CO2共同进行超临界萃取的过程中，芹菜素的萃取率升高至0.006%。

表3 使用CO2和95%乙醇共同萃取过程中芹菜素含量Table 3 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2+95%EtOH

使用CO2和99%乙醇共同萃取过程中芹菜素含量见表4。由表4可见，以99%浓度乙醇为夹带剂所萃取出的芹菜素含量低于95%浓度的乙醇，推测造成该现象的原因可能是增加乙醇浓度使得原料的湿度增加造成原料结块，不利于溶质分子与溶剂分子间的传质，降低了萃取率。在整个萃取过程中，前30 min萃取效率最高，120 min时芹菜素几乎完全被萃取出来。在使用99%浓度的乙醇为夹带剂与CO2共同进行超临界萃取的过程中，芹菜素的萃取率降至0.005%。

表4 使用CO2和99%乙醇共同萃取过程中芹菜素含量Table 4 Apigenin content at different time periods in the process of SFE CO2+99%EtOH

2.3 萃取过程分析

超临界流体萃取过程中芹菜素含量变化曲线见图3。如图3所示，在仅使用CO2而不加入其他夹带剂萃取芹菜素时，萃取效果最差，且其在前90 min内几乎检测不到明显的芹菜素信号；在添加乙醇夹带剂与CO2共同进行超临界萃取时，芹菜素的得率有明显提高，这可能是因为芹菜素更易溶于极性溶剂。在使用夹带剂辅助提取的过程中，浓度为95%的乙醇的提取效率要高于浓度为99%的乙醇，这说明适当浓度的乙醇可以降低限制超临界流体萃取芹菜根中芹菜素的因素，但当浓度过高时也会降低传质效率从而抑制芹菜素的萃取。