KDM6A基因对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡的影响

骆婷婷,刘 洋,张 瑞,于文燕

(1新疆医科大学第一附属医院血液病中心实验室,乌鲁木齐 830054;2新疆医科大学基础医学院;*通讯作者,E-mail:945265580@qq.com)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类血液系统恶性肿瘤,其特征主要是血液和骨髓中髓系原始细胞的异常克隆扩增[1],在我国常见于成人,且发病率随着年龄的增长呈上升趋势[2,3]。现已研究确定该病主要生物学特征是细胞增殖失控,治疗手段也主要针对这一生物学特征进行,但是,还是存在一部分患者停药复发等问题[4]。随着对白血病发病分子机制深入研究,靶向治疗成为白血病治疗的发展趋势[5]。赖氨酸特异性去甲基化酶6A(lysine-specific demethylase 6A,KDM6A)主要是组蛋白H3的第27位赖氨酸(histone H3 at lysine 27,H3K27)去甲基化酶,可以催化H3K27三甲基化(H3K27 tri-methylated，H3K27me3)去甲基化，促进基因表达,在胚胎发育过程中起到重要的作用[6,7]。已有研究报道,KDM6A突变和缺失参与多种肿瘤的发生发展,包括食管癌、结肠癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤[8-11]等。但KDM6A在急性髓系白血病中作用尚不清楚。本实验分别通过过表达和敲减KDM6A基因,来观察对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

人组织细胞淋巴瘤细胞U937购自美国ATCC(货号:DA-C5751)。BCA蛋白检测试剂盒(货号:23250)、MTT检测试剂盒(货号:4890-025-K)购自上海嵘崴达实业有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号:556547)及流式细胞仪购自美国BD公司;脂质体LipofectamineTM2000(货号:11668027)购自美国Invitrogen;PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser Kit(Perfect Real Time)(货号:RR047AA)、SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(货号:RR820A)购自日本TAKARA公司;GAPDH兔多抗购自美国Bioworld公司;兔抗人KDM6A(货号:ab36938)、兔抗人H3K27me3(ab192985)、兔抗人Caspase-3(货号:ab13748)购自美国Abcam;兔抗人c-Myc(货号:MAB3696)、兔抗人Cyclin D1(货号:MAB4314)、兔抗人Bcl-2(货号:MAB8272)、兔抗人Bax(货号:MAB846)购于美国R&DSYSTEMS;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(货号:sc2004)购自美国Santa Cruz公司。

二氧化碳恒温细胞培养箱购自美国SHEL-LAB公司;酶联免疫标记分析仪购自芬兰雷勃Multiskan MK-3;倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司;荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 取出冻存管,进行U937细胞复苏,快速加入预热的完全培养基中,细胞贴壁后,从培养箱取出细胞瓶进行换液,向培养瓶中加入适量的10%FBS RPMI-1640培养基置于CO2培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养。一般隔两天换液1次,待细胞长满瓶壁85%左右进行细胞传代。将细胞按实验分5组:U937细胞组、sh-control组、sh-KDM6A组、pcDNA3.0组、pcDNA3.0-KDM6A组,其中sh-control组、sh-KDM6A组、pcDNA3.0组、pc-DNA3.0-KDM6A组细胞使用LipofectamineTM2000分别转染慢病毒空载体、shKDM6A慢病毒载体、pcDNA3.0、pcDNA3.0-KDM6A过表达载体。

1.2.2 shKDM6A慢病毒载体包装与稳转U937细胞系建立 以1.6×106/瓶的密度接种U937细胞于T25细胞培养瓶;培养至细胞融合度40%左右,进行转染LipofectamineTM2000 ∶质粒=2 ∶1;轻轻混匀,室温静置15 min;室温静置结束后滴加入T25细胞培养瓶中,37 ℃,5%CO2培养;6-8 h后更换为10%FBS RPMI-1640完全培养;48 h后收取上清中的慢病毒;以2×105个细胞/孔的密度接种U937细胞于6孔板;培养至细胞融合度30%-40%,弃去1 ml培养基,加入1 ml慢病毒感染细胞;48 h用含10 μg/ml嘌呤霉素10%FBS RPMI-1640完全培养基持续筛选;继续使用含2 μg/ml嘌呤霉素RPMI-1640完全培养基筛选维持,待感染效果鉴定。

1.2.3 pcDNA3.0-KDM6A过表达载体构建 从NCBI获取KDM6A基因cDNA序列(NM-001291415.2),设计引物送上海生工生物有限公司进行合成,以U937细胞cDNA为模板PCR扩增,切胶回收目的片段,经AgeⅠ和XhoⅠ双酶切后,插入pcDNA3.0真核表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定,构建pcDNA3.0-KDM6A真核表达载体,用于后续实验。

1.2.4 MTT法检测细胞增殖 根据实验需求进行细胞培养,以1×105cell/ml接种于96孔板中,每孔100 μl,在培养48 h后,加入10 μl的MTT溶液,37 ℃继续培养4 h。弃去孔内培养基,每孔加入150 μl DMSO震荡混匀,用酶标仪检测492 nm的OD值。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。重复上述实验3次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡检测试剂盒用于检测细胞凋亡。培养24 h后,按照试剂盒的说明书,分别在细胞中先添加FITC-AnnexinⅤ 5 μl再添加PI 5 μl,然后进行20 min室温避光反应,并采用流式细胞术观察计算。

1.2.6 qRT-PCR检测KDM6A、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达水平 Trizol法进行RNA提取:静置5 min使细胞完全裂解;每1 ml Trizol试剂加入200 μl氯仿;反转录所得cDNA存放-20 ℃。并通过SYBR Green试剂盒检测KDM6A、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达水平。循环条件如下:95 ℃ 10 min,然后是94 ℃ 10 s,58 ℃ 25 s和72 ℃ 30 s,32个循环,然后72 ℃ 10 min。荧光定量引物见表1。

表1 实验所用qRT-PCR引物

1.2.7 Western blot检测KDM6A、H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平 按照实验分组处理细胞后48 h,收取细胞总蛋白。使用细胞刮刮取细胞至EP管中,高速离心,收集沉淀,加入蛋白裂解液进行裂解,BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度,99 ℃蛋白变性,10%SDS凝胶电泳分离蛋白,转膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,加入兔抗KDM6A(1 ∶500)、H3K27me3(1 ∶1 000)、c-Myc(1 ∶1 000)、Cyclin D1(1 ∶200)、Bcl-2(1 ∶500)、Bax(1 ∶1 000)、Caspase-3(1 ∶500),4 ℃冰箱孵育过夜,TBST洗涤后加入山羊抗兔二抗(1 ∶5 000)孵育1 h,ECL底物显色。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 qRT-PCR检测KDM6A转染效率

与U937细胞组相比,sh-control组、pcDNA3.0组中KDM6A mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05);与sh-control组相比,sh-KDM6A组中KDM6A mRNA表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-KDM6A组中KDM6A mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 不同处理组U937细胞中KDM6A mRNA的表达

2.2 敲减和过表达KDM6A对细胞存活率影响

与U937细胞组相比,sh-control组、pcDNA3.0组细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05);与sh-control组相比,sh-KDM6A组细胞存活率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-KDM6A组细胞存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 不同处理组对U937细胞增殖影响

2.3 敲减和过表达KDM6A对细胞凋亡影响

与U937细胞组相比,sh-control组、pcDNA3.0组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);与sh-control组相比,sh-KDM6A组细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-KDM6A组细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表4、图1)。

表4 不同处理组对U937细胞凋亡影响

图1 不同处理对U937细胞凋亡的影响Figure 1 U937 cell apoptosis in different treatment groups

2.4 敲减和过表达KDM6A对细胞增殖、凋亡相关蛋白表达的影响

与U937细胞组相比,sh-control组、pcDNA3.0组H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与sh-control组相比,sh-KDM6A组细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显降低(P<0.05),H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与pcDNA3.0组相比,pcDNA3.0-KDM6A组细胞Bax、Caspase-3蛋白表达水平明显升高(P<0.05),H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05,见表5、图2)。

表5 不同处理组对细胞增殖、凋亡相关蛋白的影响

3 讨论

AML是一种血液系统恶性肿瘤,严重危害着人类健康。在过去的50年,AML相关研究已经取得了很大的进步。传统的白血病治疗,药效已经达到极限,疗效很难再有提高。因此,寻找新的与AML发生密切相关的基因,筛选新靶点对于AML的治疗有着重要的意义。

KDM6A,又名UTX,定位于人的Xp11.3-p11.23染色体区域[12],包含1个JmiC功能域和6个四肽重复结构域(TPR),JmiC结构域与组蛋白去甲基化有关。组蛋白甲基化修饰是表观遗传学中重要的调控机制之一,在基因的激活和抑制中发挥重要的作用,决定细胞的增殖、凋亡等多种生物学过程。KDM6A主要通过对组蛋白3赖氨酸27(H3K27)去甲基化或乙酰化的表观遗传学机制参与肿瘤的发生发展,已被证明参与多种肿瘤的发展。有研究报道,H3K27去甲基化酶KDM6A与KMT2B协同作用,通过调节H3K4me3在非小细胞肺癌(NSCLC)中发挥致癌作用[13]。在人类浸润性乳腺癌中,KDM6A被认为是介导上皮-间质转化(EMT)的重要因素[14,15]。KDM6A在肺癌细胞中对表皮-间质转化的表观遗传调控[16]。以上研究结果表明,KDM6A在肿瘤中起到致癌的作用,但是也有研究表明,KDM6A在肿瘤研究过程中起到抑癌的作用,KDM6A的缺失是膀胱癌表型的驱动因素,KDM6A沉默促进了癌细胞生长和迁移[17]。在急性T淋巴细胞白血病的小鼠模型中,KDM6A通过调节许多具有肿瘤抑制功能的基因进而调节肿瘤的发生发展[18]。Li等[19]研究发现,沉默KDM6A使患者的生存时间缩短。在大肠癌中,KDM6A通过正向调节E-钙黏蛋白抑制肿瘤细胞的侵袭[20]。根据胰腺癌基因组的公共数据库分析,大约10.7%-21.6%的胰腺癌患者样本中,KDM6A基因发生了突变[21]。KDM6A突变也存在于其他癌症中,包括前列腺癌[22]、髓母细胞瘤[23]。在本研究中,KDM6A作为组蛋白去甲基化酶,控制着基因表达的激活和抑制,我们通过敲减KDM6A的细胞模型发现,KDM6A敲低后细胞存活率、H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著降低,其蛋白表达与对照组之间的差异存在统计学意义,H3K27me3被认为是KDM6A主要发挥去甲基化作用的对象,c-Myc和Cyclin D1蛋白被普遍认为与细胞的增殖相关,Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白被普遍认为与细胞的凋亡相关,这说明KDM6A可能发挥去甲基化作用降低H3K27me3水平,在AML的增殖、凋亡过程中起到重要的作用。我们通过转染pcDNA3.0-KDM6A过表达质粒发现,细胞存活率、H3K27me3、c-Myc、Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平显著降低,而细胞凋亡率、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高。这与我们的敲减结果完全相反。说明KDM6A在急性髓系白血病细胞中扮演着重要的角色。KDM6A在不同的肿瘤中发挥不同的作用,我们考虑可能是因为KDM6A在细胞内通过激活不同的抑癌基因或促癌基因从而导致了相反的结果,后续还需要对其分子机制进行相应研究。

1.U937细胞组;2.sh-control组;3.sh-KDM6A组;4.pcDNA3.0组;5.pcDNA3.0-KDM6A组图2 不同处理组对细胞增殖、凋亡相关蛋白的影响Figure 2 Expression of cell proliferation-and apoptosis-associated proteins in different treatment groups by Western blot

本研究发现,过表达KDM6A可抑制急性髓系白血病细胞增殖、促进细胞的凋亡;敲减KDM6A能够促进急性髓系白血病细胞增殖、抑制细胞凋亡。但是本研究只说明了KDM6A在AML的增殖及凋亡过程中发挥了重要的作用,其具体的分子机制及其对患者预后效果的影响还需进行进一步的探究。