益脑心颗粒制备中7个活性成分转移率的研究

王 鑫,黄美玲,苏玉霞,任晓东,刘 涛,陈明会*

(1汉中市人民医院药剂科,汉中 723000;2汉中市铁路中心医院重症医学科;3西安交通大学第一附属医院药学部;*通讯作者,E-mail:951036067@qq.com)

益脑心颗粒(国药准字Z20025079),具有活血散瘀,平肝熄风等功效,由六味中药即天麻、山楂、郁金、丹参、制何首乌、川芎组成[1-3]。方中川芎含有腺苷、没食子酸、阿魏酸等成分,其对心血管疾病、中枢神经系统有治疗作用[4-6];天麻含有没食子酸、5-羟甲基糠醛、天麻素、腺苷等成分,具有镇静催眠与脑保护等作用[7-9];何首乌含有没食子酸、二苯乙烯苷类、腺苷等成分,具有明显的神经保护与抗衰老等作用[10-12];郁金有抗炎、肿瘤等作用[13];山楂有较高含量的没食子酸,有抗氧化作用[14-19];丹参中含丹酚酸B、迷迭香酸、5-羟甲基糠醛等成分,有改善微循环、抗凝血等作用[20,21]。前期笔者对益脑心颗粒进行了定性研究,并鉴定出制剂中的丹酚酸B、迷迭香酸、二苯乙烯苷、5-羟甲基糠醛、没食子酸、天麻素、腺苷等成分[22]。本文旨在通过建立HPLC法测定益脑心颗粒与药材中的7个活性成分的含量,探讨7种成分在制备过程中的转移情况,为制剂的质量控制提供科学依据,为临床应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

岛津Prominence UFLC型高效液相色谱仪,配SPD-M20A二极管阵列检测器与LC/Labsoluion色谱工作站,日本岛津公司;KQ-100DA台式数控超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司;十万分之一电子分析天平,型号MD200,德国赛多利斯公司;0.45 μm微孔滤膜,东莞市皇贤科学仪器有限公司。乙腈、甲醇,色谱级,美国Fisher公司;水为娃哈哈纯净水,公司名称杭州娃哈哈集团有限公司;磷酸、无水乙醇均为分析纯,北科化学天津有限责任公司。腺苷(批号10879-201703,质量分数99.7%)、天麻素(批号110807-202010,质量分数95.5%)、没食子酸(批号110831-201906,质量分数91.5%)、5-羟甲基糠醛(批号111626-202013,质量分数99.5%)、迷迭香酸(批号111871-202007,质量分数98.1%)等对照品均购自中国食品药品检定研究院;二苯乙烯苷(批号HO118401,质量分数98%)、丹酚酸B(批号HS034208,质量分数98%),购于宝鸡辰光生物技术有限公司;药材与益脑心颗粒(国药准字Z20025079,规格7 g×9袋/盒),购自陕西汉王药业股份有限公司,药材与制剂对应关系见表1。

表1 药材与制剂对应关系

1.2 含量测定方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),按表2进行梯度洗脱。记录时间:70 min。体积流量:0.8 ml/min;柱温:28 ℃;检测波长:270 nm;进样量:10 μl[22]。

表2 梯度洗脱程序方法

1.2.2 各种溶液的制备

1.2.2.1 混合对照品溶液的配制 分别精密称取没食子酸5.46 mg,5-羟甲基糠醛8.04 mg于100 ml量瓶中,加50%甲醇至刻度,摇匀,作为A溶液;再分别精密称取腺苷18.05 mg,天麻素5.86 mg,二苯乙烯苷3.06 mg,迷迭香酸4.08 mg,丹酚酸B 20.41 mg置于10 ml量瓶中,加A溶液至刻度,摇匀,即得7种混合对照溶液,作为储备液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取本品5袋内容物,研细,混匀,取7 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇25 ml,称定质量,超声处理(功率100 W,频率100 Hz)30 min,取出,放冷,再称定质量,用50%乙醇补足其减失的质量,摇匀,0.45 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液得到供试品溶液[22]。

1.2.2.3 阴性样品溶液的制备 按益脑心颗粒处方分别制备缺天麻样品(天麻素阴性对照),缺制首乌样品(二苯乙烯苷阴性对照),缺丹参样品(迷迭香酸与丹酚酸B阴性对照),缺天麻、山楂、川芎与制首乌样品(没食子酸阴性对照与腺苷阴性对照),缺天麻与丹参(5-羟甲基糠醛阴性对照)的阴性样品;再按“1.2.2.2”项下方法分别制备各阴性样品溶液。

1.2.2.4 天麻药材溶液的制备 取本品粉末0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇25 ml,称定质量,超声处理(功率100 W,频率100 Hz)30 min,取出,放冷,再称定质量,用50%乙醇补足其减失的质量,摇匀,0.45 μm的微孔滤膜过滤,取续滤液得到供试品溶液。

1.2.2.5 制首乌药材溶液的制备 溶液的制备同“1.2.2.4”项。

1.2.2.6 丹参药材溶液的制备 溶液的制备同“1.2.2.4”项。

1.2.2.7 川芎药材溶液的制备 溶液的制备同“1.2.2.4”项。

1.2.2.8 山楂药材溶液的制备 溶液的制备同“1.2.2.4”项。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 线性关系考察 分别精密量取储备液0.010,0.050,0.250,0.500,1.000 ml置于各个2 ml量瓶中,分别加50%甲醇定容,混匀,即得系列混合对照溶液。用0.45 μm微孔滤膜滤过,进样。以各对照品的浓度(μg/ml)为横坐标(x),峰面积值为纵坐标(y)进行线性回归。

1.2.3.2 专属性试验 分别精密量取混合对照溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl进样,分别记录色谱图。

1.2.3.3 精密度试验 精密吸取供试品溶液(批号010012),重复进样6次,测得腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面积的RSD值。

1.2.3.4 稳定性试验 精密吸取供试品溶液(批号010012),在第0,2,4,8,12,24小时进样。测定腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面积的RSD值。

1.2.3.5 重复性试验 精密称取样品(批号010012)6份,分别按“1.2.2.2”项下方法制备供试品,按“1.2.1”项下条件测定。测定平均含量与RSD值。

1.2.3.6 加样回收率试验 取本品(批号010012)内容物,添加对照品后,照“1.2.2.2”项下方法制备样品溶液,按照“1.2.1”项下色谱条件测定,制备6份样品溶液,测定峰面积计算加样回收率。

1.2.3.7 药材含量测定 分别精密称取川芎、制何首乌、丹参、郁金、山楂、天麻样品0.5 g,分别按“1.2.2.4-1.2.2.8”项下方法制备药材供试品,按“1.2.1”项下条件测定。

1.2.3.8 制剂含量测定 精密称取9批样品,分别按“1.2.2.2”项下方法制备供试品,按“1.2.1”项下条件测定。测定腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量(mg/g)。

1.2.4 转移率 依据如下公式计算:药材中成分转移率(%)=对应制剂中成分总含量(mg)/处方药材成分总含量(mg)×100%。

2 结果

2.1 线性关系考察

结果表明7种对照品在相应浓度范围内线性关系良好(见表3)。

表3 对照品的线性方程、线性浓度范围及相关系数

2.2 专属性试验

结果表明阴性对照无干扰,专属性强(见图1)。

1.腺苷;2.天麻素;3.没食子酸;4.5-羟甲基糠醛;5.二苯乙烯苷;6.迷迭香酸;7.丹酚酸B图1 混合对照品、供试品、阴性对照样品HPLC色谱图Figure 1 High performance liquid chromatogram of mixed control samples, test samples and negative control samples

2.3 精密度试验

结果显示,腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.95%,0.93%,0.89%,1.02%,0.94%,0.91%,0.87%,均小于2.0%(见表4),表明该方法精密度良好。

表4 精密度试验结果

2.4 稳定性试验

结果显示,腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.82%,0.96%,1.13%,1.01%,1.21%,1.15%,1.08%,均小于2.0%(见表5),表明供试品溶液在24 h内稳定。

表5 稳定性试验结果

2.5 重复性试验

结果显示,腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面积,计算得平均含量的RSD均小于2.5%(见表6),表明该方法重复性良好。

表6 重复性试验结果

2.6 加样回收率试验

结果显示,腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的峰面积,分别计算得各成分平均回收率在97%-99%之间,各成分RSD均小于2.0%(见表7),表明该方法回收率良好。

表7 加样回收率试验结果

2.7 药材含量测定

药材含量测定的结果见表8。天麻中腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟基糠醛的平均含量分别为10.732 5 mg/g,11.107 4 mg/g,2.660 5 mg/g,27.233 2 mg/g;制首乌中腺苷、没食子酸、二苯乙烯苷的平均含量分别为2.247 4 mg/g,16.136 8 mg/g,7.074 4 mg/g;丹参中5-羟基糠醛、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量分别为109.446 8 mg/g,2.042 0 mg/g,31.988 4 mg/g;川芎中腺苷、没食子酸的平均含量分别为482.166 8 mg/g,10.592 0 mg/g;山楂中没食子酸的平均含量为22.197 4 mg/g。

表8 三批药材7个成分测定结果

2.8 制剂含量测定

制剂含量测定的结果见表9。010012,010013,010014,010017,010018,010019,010021,010022,010023批中腺苷、天麻素、没食子酸、5-羟甲基糠醛、二苯乙烯苷、迷迭香酸、丹酚酸B的平均含量分别为0.477 41 mg/g,0.680 90 mg/g,0.051 40 mg/g,0.130 06 mg/g,1.146 14 mg/g,0.342 45 mg/g,4.753 30 mg/g。

表9 批益脑心颗粒中7个成分含量试验结果 (mg/g)

2.9 转移率

7个成分的转移率均超过50%,RSD均小于3%,最小转移率成分为二苯乙烯苷,最大转移率成分为天麻素(见表10)。

表10 三批药材对应9批制剂转移率测定结果

3 讨论

3.1 色谱条件

使用二极管阵列检测器对益脑心颗粒样品进行全波长扫描,结果表明腺苷的最大吸收波长为265 nm,天麻素为220 nm和269 nm,没食子酸为271 nm,5-羟甲基糠醛为281 nm,二苯乙烯苷为309 nm,迷迭香酸为311 nm,丹酚酸B为288nm,因此依据每个化合物的最大吸收值,确定共同检测波长为270 nm。色谱条件的选择与供试品制备方法依据文献[22]。

3.2 专属性实验研究

腺苷在川芎、天麻、制首乌中均含有,所以阴性对照制备供试品是需要去除;没食子酸在天麻、山楂、川芎、制首乌含有,制备阴性对照时需要去掉天麻、山楂、川芎、制首乌;5-羟甲基糠醛在天麻、丹参中均含有,制备阴性对照时需要去掉天麻、丹参;二苯乙烯苷仅在制首乌中含有,制备阴性对照时需要去掉制首乌;迷迭香酸、丹酚酸B仅在丹参中含有,制备阴性对照时需要去掉丹参;天麻素仅在天麻中含有,制备阴性对照时需要去掉天麻。

3.3 转移率研究

对3批药材对应9批益脑心颗粒中7种成分含量分析,结果,平均转移率大小顺序:天麻素>迷迭香酸>没食子酸>腺苷>5-羟甲基糠醛>丹酚酸B>二苯乙烯苷。二苯乙烯苷转移率较低可能是在生产过程中受光照、温度及空气中氧化等原因影响[23,24],但转移率均在50%以上,表明药材中7种活性成分的转移率较高,说明制剂工艺良好,很好地控制了制剂质量。

综上所述,成功建立益脑心颗粒7种成分的HPLC含量测定方法,该方法操作简单易于实施、准确、稳定、重复性好、专属性强,因此该方法可作为益脑心颗粒质量的有效评价方法之一;7种成分的转移率较高,表明制剂的制备工艺有利于7个活性成分的转移,为制剂生产提供了科学依据,为制剂疗效提供了理论基础。