中国山西汉族人群rs5888及rs1207568位点单核苷酸多态性与脑梗死合并糖尿病易感性的关系

赵辰生,西 颖,潘阿晓,刘玉婷,程 娜,王智云,柴秀琴,杨 阳,安丽荣,胡 涛

(1山西省心血管病医院神经内科,太原 030024;2山西省人民医院神经外科;*通讯作者,E-mail:namucuoo2000@sina.com)

脑梗死(cerebral infarction,CI)属于临床常见疾病,发病率、致残致死率高,发病涉及多因素,对患者造成严重影响[1]。糖尿病(diabetes mellitus,DM)并发脑血管病的发生率为16.4%-18.6%,而糖尿病合并脑梗死占糖尿病并发脑血管病的89.1%;同时,约1/3的脑梗死患者患有糖尿病[2]。研究表明,遗传基因在脑梗死发病中可能起重要作用。近年来,探讨脑梗死的遗传易感基因标记及基因多态性与脑梗死相关关系的研究越来越受到学者们的重视[3]。糖代谢异常是脑梗死的危险因素[4],大量研究均证实脑梗死的发生与2型糖尿病有关,其并发脑梗死的相对危险程度是非糖尿病患者的2-3倍[5]。血糖升高可引起脂代谢紊乱,同时引发组织蛋白非酶糖化,加速加重动脉粥样硬化形成。

SCARB1基因全称为scavenger receptor class B member 1,该基因编码的蛋白质是高密度脂蛋白胆固醇(HDL)的质膜受体,编码的蛋白质介导胆固醇与HDL的相互转移。研究表明[6],HDL刺激清道夫受体B类1型(SR-B1)促进肝脏吸收胆固醇,而该受体正是由SCARB1基因编码的。高密度脂蛋白对冠心病的临床诊断是一个重要的参考指标。它的升高是临床冠心病保护因子之一,并能防治和延缓动脉粥样硬化的发展。因此,SCARB1基因的罕见突变与冠心病(CHD)相关[6]。Ma等[6]的研究搜索了病例对照研究和队列研究的数据库后认为,多态性rs5888与冠心病的发生呈负相关,尤其是在男性中表现尤甚。

KL基因全称为Klotho,该基因编码与β-葡萄糖苷酶有关的I型膜蛋白。2018年,Flotyńska等[7]的研究探讨了1型糖尿病患者的Klotho蛋白功能。研究认为,成纤维细胞生长因子23(FGF23)和Klotho系统浓度的变化可能是糖尿病慢性并发症或治疗选择的标志。此外,Klotho基因多态性与健康衰老有关。2019年,Zhu等[8]研究表明,Klotho G-395 A多态性与尿石症和心血管疾病有关,Klotho F352 V多态性与癌症和长寿有关,F等位基因在决定人类寿命方面起着保护作用。由此可见,KL基因的多态性同样可能与脑梗死的发生具有密切的关系。

关于SCARB1基因和KL基因的基因多态性与糖尿病合并脑梗死易感性之间关系的临床数据分析尚未见于中国山西汉族人群。本研究旨在探讨脑梗死患者SCARB1基因rs5888位点,以及KL基因rs1207568位点单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与未患有脑梗死或糖尿病对照者之间的关系,揭示SCARB1基因与KL基因的基因多态性与汉族人群糖尿病合并脑梗死易感性的关系。在山西省,本研究可能为糖尿病合并脑梗死易感性筛查和预防性干预提供可用的遗传易感性标记,这将有利于未来开展糖尿病和脑梗死的预测性筛查,有助于早期发现糖尿病和脑梗死的潜在致病基因并进行预防性干预。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析工具

基于NCBI,Protscale,SignalP,TMHMM,PSORT,ProtParam和SecretomeP数据库或软件,对SCARB1和klotho基因的结构、理化性质、表达和分布进行基本的预测分析。表1中显示了所使用的软件URL(Uniform Resource Locator,统一资源定位器,网络地址)。

表1 本研究使用的生物信息学软件或数据库及其URL

1.2 患病及对照受试者的基本特征

2019年1月至2019年6月,收集在山西心血管医院的脑梗死合并2型糖尿病的临床病例,所有病例均符合1995年第四届全国脑血管会议修订的脑梗死诊断标准。总共从山西省选出了173例汉族人群参加研究,49例脑梗死合并糖尿病患者、52例脑梗死患者和39例糖尿病患者为研究对象,33例无脑梗死或糖尿病患者为对照组,研究获得受试者的知情同意和本院伦理委员会的批准。抽取所有患病及对照受试者的外周血,每位受试者5 ml。血样分别测量并记录其HDL-C、LDL-C、尿酸、同型半胱氨酸等临床相关指标,同时进行基因特异性扩增和二代基因测序法进行测序,获得基因单核苷酸多态性(SNP)信息,并对结果进行统计学分析。

1.3 DNA的提取

对所有病例和对照人群的外周血样,使用DNA血液试剂盒从外周有核血细胞中分离出DNA。将提取出的DNA保存在4 ℃下备用,随后分析所有患病及对照受试者的SCARB1基因和Klotho基因的SNP。

1.4 rs5888和rs1207568位点基因分型检测

采用聚合酶链式反应突变扩增系统(polymerase chain reaction amplification refractory mutation system,ARMS-PCR)分析SCARB1的rs5888和Klotho的rs1207568位点序列,设计原则是在PCR产物中加入SNP突变位点,并保证引物的上下端之间有一定的距离。使用DNA Clean&Concentrator TM-5(ZYMO RESEARCH,目录号D4013)试剂盒纯化DNA样品进行纯化。通过紫外测量和电泳测试所制备样品合格。DNA的定量信息使用Nano Drop UV分光光度计测定的紫外吸光度值表示,样品的A260/A280在1.8-2.1之间。用0.7%琼脂糖凝胶电泳检测,筛选合格样品。

1.5 统计学分析

使用SPSS 21.0(美国伊利诺伊州芝加哥SPSS公司)统计软件进行统计分析。基线数据表示为均值±标准差。基因型频率定义为携带突变等位基因的受试者的百分比。等位基因频率定义为在群体中检测到的突变等位基因的百分比。使用卡方检验分析疾病关联,两组间计量资料的比较用独立样本t检验,当P<0.05时被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SCARB1和Klotho的生物信息学分析结果

2.1.1 SCARB1基因总体预测结果 SCARB1基因位于人类第12号染色体,位置为12q24.31,共含有15个外显子。SCARB1基因所编码的蛋白由481个氨基酸组成,其分子式为C2452H3771N617O683S32,分子量为53 847.56。组成SCARB1蛋白的氨基酸中,负电荷残基总数(Asp+Glu)为41,正电荷残基总数(Arg+Lys)为43。经ProtParam软件预测,该蛋白的理论等电点为7.97,属于弱碱性蛋白。SCARB1蛋白的理论消光系数由ProtParam提供,消光系数以(mol/L)-1·cm-1为单位,在水溶液中波长280 nm处测量。当假设所有Cys残基都形成胱氨酸时,Abs 0.1%(=1 g/L)为1.269;当假设所有Cys残基都消除时,Abs 0.1%(=1 g/L)为1.260。ProtParam软件还对SCARB1蛋白的半衰期、稳定性、脂肪系数、亲疏水性等基本性质做出了预测。预测结果显示,SCARB1蛋白氨基酸序列的N端氨基酸为甲硫氨酸,其在哺乳动物网织红细胞中的半衰期可达30 h。SCARB1的计算失稳指数(II)为34.00,被ProtParam软件判定为稳定蛋白。该蛋白的脂肪指数为82.47,亲水性(GRAVY)总平均值为-0.004。

2.1.2 SCARB1蛋白亲疏水性预测结果 Protscale软件对SCARB1蛋白更为详细的亲疏水性预测结果见图1,其中,最低点位于第453号的丝氨酸残基,得分为-2.733,最高点位于第27位的缬氨酸残基和第28位的甲硫氨酸残基,得分均为2.900。软件分析结果认为,SCARB1蛋白应为亲水性蛋白。

图1 SCARB1蛋白的亲疏水性预测结果Figure 1 The prediction results of the hydrophilicity and hydrophobicity of SCARB1 protein

2.1.3 SCARB1信号肽结构的分析结果 SignalP 4.0 Server对SCARB1信号肽结构的分析结果见图2。在这项预测中,SCARB1蛋白的氨基酸序列第26位处C值达到最大,为0.273;第9位氨基酸处Y值达到最大,为0.228;S值的最大值位于第6位氨基酸处,得分0.544,平均值(1-8位)为0.893。按照软件预测结果,SCARB1蛋白是不存在信号肽结构的。SecretomeP 2.0 Server对SCARB1蛋白的非经典蛋白质分泌做出了预测,该蛋白的SecP得分(NN-得分)为0.408 960,未超过哺乳动物推荐阈值0.6,因此SCARB1蛋白不是非经典分泌蛋白。

图2 SCARB1信号肽结构的分析结果Figure 2 Analysis results of SCARB1 signal peptide structure

2.1.4 SCARB1蛋白的跨膜结构预测结果 SCARB1蛋白的跨膜结构由TMHMM Server v. 2.0预测,结果见图3,该蛋白在第13-35位氨基酸处存在一个跨膜结构,第1-12位氨基酸位于膜内,第36-481位氨基酸位于膜外。

图3 SCARB1蛋白的跨膜结构Figure 3 Transmembrane structure of SCARB1 protein

2.1.5 SCARB1组织表达特异性结果 NCBI的Nucleotide数据库为确定所有蛋白质编码基因的组织特异性,对代表27种不同组织的95个人类组织样本进行了RNA-seq。统计结果显示(见图4),SCARB1在肾上腺中的表达最为广泛,其RPKM(reads per kilobase per million mapped reads,每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数)为333.624±44.562,在胰腺中的表达最少,其RPKM为0.875±0.013。

图4 SCARB1在组织中的表达情况Figure 4 SCARB1 expression in the tissues

2.1.6 SCARB1蛋白的亚细胞定位预测结果 PSORT Ⅱ对SCARB1蛋白的亚细胞定位预测结果如下,EDN1蛋白主要位于过氧化物酶体中(占33.30%),线粒体中占22.20%,细胞质中占22.20%,细胞核中占22.20%。

2.1.7 klotho基因总体预测结果 klotho基因位于人类第13号染色体,位置为13q13.1,共含有6个外显子。klotho基因所编码的蛋白由1 012个氨基酸组成,其分子式为C5337H8024N1410O1452S30,分子量为116 132.80。组成Klotho蛋白的氨基酸中,负电荷残基总数(Asp+Glu)为102,正电荷残基总数(Arg+Lys)为105。经ProtParam软件预测,该蛋白的理论等电点为8.06,属于碱性蛋白。当假设所有Cys残基都形成胱氨酸时,Klotho蛋白的理论消光系数Abs 0.1%(=1 g/L)为2.056;当假设所有Cys残基都消除时,Abs 0.1%(=1 g/L)为2.049。Klotho蛋白氨基酸序列的N端氨基酸为甲硫氨酸,它在哺乳动物网织红细胞中的半衰期为30 h。Klotho的计算失稳指数(II)为41.72,被ProtParam软件判定为不稳定蛋白。该蛋白的脂肪指数为83.69,亲水性总平均值为-0.264。

2.1.8 Klotho蛋白亲疏水性预测结果 Protscale软件对Klotho蛋白的亲疏水性预测结果见图5,其中,最低点位于第1 008位的精氨酸残基,得分为-2.667,最高点位于第986位的异亮氨酸残基,得分为3.100。从图中可以看出,Klotho蛋白的氨基酸残基大多位于零点以下的负值亲水区域,因此该蛋白应为亲水性蛋白。该结论与ProtParam预测到的结论相同,互为印证,可信度较高。

图5 Klotho蛋白的亲疏水性预测结果Figure 5 The prediction results of the hydrophilicity and hydrophobicity of Klotho protein

2.1.9 klotho信号肽结构的分析结果 SignalP 4.1 Server对klotho信号肽结构的分析结果见图6。在这项预测中,Klotho蛋白的氨基酸序列第34位处C值与Y值达到最大,分别为0.494和0.594,S值的最大值位于第7位,为0.893,S值平均值(1-33位)为0.669。因此,按照判定标准,Klotho蛋白是可能存在信号肽结构的。

图6 klotho信号肽结构的分析结果Figure 6 Analysis results of klotho signal peptide structure

2.1.10 Klotho蛋白的跨膜结构预测结果 Klotho蛋白的跨膜结构预测结果见图7,该蛋白在第982-1004位处存在一个跨膜结构,第1-981位位于膜内,第1005-1012位位于膜外。

图7 Klotho蛋白的跨膜结构Figure 7 Transmembrane structure of Klotho protein

2.1.11 klotho组织表达特异性结果 NCBI对klotho进行RNA-seq分析后的统计结果显示,klotho在肾脏中的表达最为广泛,其RPKM为80.634±30.462,在骨髓中的表达最少,其RPKM为0.05±0.045(见图8)。

图8 klotho在组织中的表达情况Figure 8 Klotho's expression in the tissues

2.1.12 Klotho蛋白的亚细胞定位预测结果 PSORT Ⅱ对Klotho蛋白的亚细胞定位预测结果如下,Klotho蛋白主要位于内质网中(占44.40%),其他部位如高尔基体中占33.30%,质膜中占22.20%。

2.2 患病及对照受试者的基本特征

患者和对照之间的年龄和性别没有显著差异(P>0.05,见表2)。各组研究对象的基本特征见表2。

表2 患病及对照受试者的基本特征

2.3 SCARB1基因rs5888及Klotho基因rs1207568的位点分析

SCARB1基因rs5888为同义替换,转录本虽然出现改变,但原丙氨酸密码子在突变并经翻译后,该位点仍为丙氨酸。图9所示的三维模型(Swiss-PdbViewer 4.1.0软件制作)展示了该突变位点的具体位置,图中紫色蛋白为突变后被替换的丙氨酸,表中表示的是SCARB1蛋白三级结构的具体信息。

Rs5888Amino acid residueBondsAnglesTorsionImproperHonbondedElectrostaticConstraintTotalAALA3502.7153.6011.6660.082-23.040.320.000 0E=-14.658

klotho基因rs1207568突变属于上游转录本变体,并未对该基因所编码蛋白的氨基酸序列造成影响,且尚未在ClinVar中有过具体临床意义的记录。图10中紫色框内所显示的序列即为rs1207568突变位点(数据获取自美国NCBI的SNP数据库)。

图10 klotho基因rs1207568位点信息Figure 10 Information of klotho gene rs1207568 locus

2.4 SCARB1基因rs5888及Klotho基因rs1207568的基因型和等位基因频率及与临床参数的关系

首先分别在SCARB1 rs5888和Klotho rs1207568的患者或对照组中对临床参数进行比较分析,结果见表3-10。经过对不同基因型受试者在凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、国际标准化比值(INR)、总胆固醇标准值(CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、尿酸(UA)、同型半胱氨酸(HCY)、血糖(BS)、糖化血红蛋白(HbA1C)等临床参数上的统计结果进行分析,认为受试者的基因型分布没有明显偏离Hardy-Weinberg平衡。测序证实SCARB1基因和klotho基因分别在rs5888和rs1207568具有基因多态性。

从表3可以看到,脑梗死合并糖尿病组除UA在Klotho rs1207568不同基因型之间差异有统计学意义(P<0.05)外,其他临床参数PT、APTT、INR、CHO、TG、HDL-C、LDL-C、HCY、BS和HbA1C在不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05)。由于CC组的例数相对比较多,CT和TT组的例数比较少,为减少统计学误差,将CT基因型和TT基因型合并为一组,进行分析。

表3 脑梗死合并糖尿病组Klotho rs1207568基因型临床参数比较

脑梗死合并糖尿病组所有临床参数在SCARB1 rs5888不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05,见表4)。

表4 脑梗死合并糖尿病组SCARB1 rs5888基因型临床参数比较

单纯性脑梗死组所有临床参数在Klotho rs1207568不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05,见表5)。

表5 单纯性脑梗死组Klotho rs1207568基因型临床参数比较

单纯性脑梗死组所有临床参数在SCARB1 rs5888不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05,见表6)。

表6 单纯性脑梗死组SCARB1 rs5888基因型临床参数比较

单纯性糖尿病组TG在Klotho rs1207568不同基因型之间差异有统计学意义(P<0.05),其他临床参数不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05,见表7)。

表7 单纯性糖尿病组Klotho rs1207568基因型临床参数比较

单纯性糖尿病组APTT在SCARB1 rs5888不同基因型之间差异有统计学意义(P<0.05),其他临床参数不同基因型之间差异无统计学意义(P>0.05,见表8)。

表8 单纯性糖尿病组SCARB1 rs5888基因型临床参数比较

对照组所有临床参数Klotho rs1207568不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05,见表9);所有临床参数SCARB1 rs5888不同基因型之间差异均无统计学意义(P>0.05,见表10)。

表9 对照组Klotho rs1207568基因型临床参数比较

表10 对照组SCARB1 rs5888基因型临床参数比较

山西省汉族173例SCARB1基因rs5888多态性的基因型和等位基因频率结果显示:脑梗死合并糖尿病患者组SCARB1 rs5888的CT/TT频率明显高于正常对照组,但CC频率低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05,见表11)。

表11 不同组患者SCARB1基因rs5888基因多态性比较 [例(%)]

山西省汉族人群Klotho基因rs1207568多态性的173例基因型和等位基因频率结果显示,各组间在Klotho rs1207568中的CT/TT和CC频率差异无统计学意义(P>0.05,见表12)。

表12 不同组患者Klotho基因rs1207568基因多态性比较 [例(%)]

3 讨论

本研究首先通过生物信息学的手段对人SCARB1及klotho基因及蛋白的相关结构和性质进行了系统的分析。研究发现,SCARB1蛋白为亲水性碱性蛋白,该结论与ProtParam预测到的结论相同,互为印证,可信度较高。SCARB1蛋白不存在信号肽结构,不是非经典分泌蛋白,该蛋白存在一个跨膜结构,主要表达于肾上腺中,并主要定位于过氧化物酶体。Klotho蛋白为亲水性碱性蛋白,可能存在信号肽结构,存在一个跨膜结构,在肾脏中的表达最为广泛,并主要定位于内质网中,预测结果与文献报道基本一致。

先前的研究发现SCARB1多态性与脂质代谢有关[9]。对SCARB1 SNP rs5888 C/T基因型的分析显示,在对照组中,TT基因型携带者中老年男性和年轻女性的血脂谱具有动脉粥样硬化保护表型[10]。同时,大量研究表明,人klotho基因多态性与血管疾病有关,可能是一个潜在的调控位点[11]。由于rs1207568存在于该基因的启动子区,不影响蛋白质的氨基酸序列,可能影响klotho基因的转录活性,从而影响klotho基因的表达,导致血管修复能力弱,导致疾病的发生。

本研究中测序结果表明SCARB1基因及klotho基因分别存在rs5888及rs1207568位点上的基因多态性。我们的研究表明,Klotho rs1207568不同基因型间临床参数比较,除脑梗死合并糖尿病组UA和单纯性糖尿病组TG有显著差异(P<0.05)外,其他临床参数均没有显著差异(P>0.05)。SCARB1 rs5888不同基因型间临床参数比较,除单纯性糖尿病组APTT有显著差异(P<0.05)外,其他临床参数均没有显著差异(P>0.05)。脑梗死合并糖尿病患者SCARB1 rs5888的CT/TT频率明显高于正常对照,但CC频率低于正常对照(P<0.05)。各组间在Klotho rs1207568中的CT/TT和CC频率差异不显著(P>0.05)。本研究表明SCARB1基因rs5888多态性与人类对糖尿病合并脑梗死的易感性密切相关,并且可能是对其进行评估的重要分子标志物。

另一方面,我们注意到,rs5888多态性导致的编码氨基酸虽然没有改变,仍然是编码丙氨酸,因此推测该多态性的生物学意义也可能通过涉及剪接调控系统的机制起到功能性作用。从这个角度来看,值得注意的是,与纯合CC或TT相比,杂合子个体中SCARB1 mRNA表达明显降低,因此该位点的基因多态性还是可以提供一个主要的基因表达负调控效应[12]。进一步的研究有望对这个有趣的问题提供更深刻的见解。

动脉粥样硬化是糖尿病的慢性并发症之一,也是脑梗死的主要致病因素,近年来,随着糖尿病发病率的不断上升,糖尿病相关并发症也成为了糖尿病患者致残、致死的主要因素[13],而合并糖尿病的脑梗死越发引起人们的重视[2]。本课题对klotho基因启动子区rs1207568多态性,以及SCARB1 rs5888单核苷酸多态性与合并2型糖尿病的脑梗死相关性的探索,是对研究相关疾病发病机制和诊治方法进行的一次探索,为该领域更进一步的研究提供一定的基础。