铜绿假单胞菌疫苗的研究进展

杨敬鹏，马翠翠 综述，王震玲 审校

1.国家药品监督管理局食品药品审核查验中心，北京100044；2.四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室，四川成都610041

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，为革兰阴性菌［1］。常见于院内感染和社区获得性感染，包括下呼吸道、外科伤口、烧伤创面、泌尿道、角膜感染等。易感人群包括慢性阻塞性肺病患者、肺纤维化患者、免疫缺陷人群、重症监护室患者以及接受机械通气的患者［2］。铜绿假单胞菌感染可导致肺炎患者和烧伤合并感染患者进一步形成败血症及脓毒血症，肺炎致死率高达30%以上，败血症致死率可达80% ~ 90%［3］。

铜绿假单胞菌感染临床主要以抗生素为治疗手段，但由于其天然耐药性以及获得性耐药的特点，目前仍缺乏有效的治疗和控制策略。根据2020年CHINET 中国细菌耐药监测数据统计结果，临床标本中铜绿假单胞菌检出率为8.42%，排名第四［4］。2019 年美国疾控中心将其列为严重威胁的耐药细菌。铜绿假单胞菌复杂的耐药机制主要包括外排泵、抗生素靶点突变、水解酶、生物膜等。因此，一般抗生素治疗很难达到彻底清除细菌的目的，甚至产生更多的耐药。疫苗接种作为一种有效的预防感染性（传染性）疾病的手段，具有不可替代的地位。20世纪60 年代起，至少有60 种针对铜绿假单胞菌的疫苗在研，疫苗靶点包括脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、胞外多糖（extracellular polysaccharide，EPS）、鞭毛、外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）、细菌毒素、外膜囊泡（outer membrane vesicle，OMV）等。疫苗的主要靶点见图1。根据技术路线不同可分为组分疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、全菌体灭活疫苗、载体疫苗。一些在研疫苗于临床前动物试验中表现出良好的保护效果，但进入临床试验阶段的仅有7种，其中3 种进入Ⅲ期临床阶段，但均宣告失败，目前尚无铜绿假单胞菌疫苗获批上市［1］。见表1。

图1 铜绿假单胞菌疫苗的主要靶点Fig.1 Main targets of P.aeruginosa vaccine

表1 铜绿假单胞菌疫苗的研发情况Tab.1 Research and development of P.aeruginosa vaccine

1 组分疫苗

1.1 LPS LPS 是革兰阴性菌细胞膜外的主要成分，主要由脂质A（lipid A）、核心寡糖（core oligosaccharide）和 O-抗原（O-antigen）构成［40］。脂质 A 是 LPS的毒性成分，可导致人体发热、腹泻，甚至内毒素性休克。O-抗原是区分细菌血清型的主要结构成分，是疫苗研究的重要靶点。根据O-抗原不同，国际抗原分型系统（International Antigenic Typing System，IATS）将铜绿假单胞菌分为 20 个血清型（O1 ~ O20）［41］。

LPS 具有良好的免疫原性，但由于其O-抗原的多样性，单一血清型疫苗仅能保护该血清型的细菌感染［42］，因此多价疫苗或许能获得比单价疫苗更高的保护效果。20 世纪60 年代最早开始研发的Pseudogen®作为一种七价LPS 疫苗，在临床试验中能显著提高烧伤患者的生存率［5］，但对于CF 患者临床感染没有改善。一种八价LPS 疫苗Aerugen®在随机双盲安慰剂对照的Ⅲ期临床试验中，将尚未感染铜绿假单胞菌的CF 患者与对照组进行疗效比较，无明显保护效果，在2006 年制造商终止了研发［6］。从上述两个多价LPS 疫苗的临床研究结果可以看出，以LPS 作为疫苗靶点，尚需克服血清交叉保护等问题。

有研究利用LPS 连接其他载体蛋白作为多糖结合疫苗，如将白喉毒素（diphtheria toxoid，DT）与LPS进行共价连接制备D-LPS-DT 疫苗，免疫小鼠后，与LPS 相比，能够提高 4 倍 IgG 抗体滴度［7-8］。此外，基于LPS 中lipid A 制备的佐剂单磷酸脂质A（monophosphoryl lipid A，MPL），已有以其作为佐剂成分的其他疫苗获批上市［43］。

1.2 EPS 铜绿假单胞菌主要产生3 种EPS，即Psl、Pel 和藻酸盐（alginate）。其中，藻酸盐是黏液型铜绿假单胞菌生物膜（biofilm）的主要成分，其产量相对Psl 和Pel 高。铜绿假单胞菌产生的EPS 结构简单，菌株间分子结构相对保守，因此是可能的抗原靶点。有研究表明，感染患者可自然产生铜绿假单胞菌藻酸盐的特异性抗体，不过这些抗体不能有效清除感染［9］。有研究将藻酸盐与一些载体蛋白连接以提高其免疫原性，将ETA 与铜绿假单胞菌PA3064 的藻酸盐制备成多糖结合疫苗，发现相对于藻酸盐能够在兔体内产生更高水平的抗藻酸盐抗体［10］。有研究将破伤风类毒素与黏液型铜绿假单胞菌株PA8821M 的藻酸盐偶联形成多糖结合疫苗，用该疫苗腹腔免疫小鼠后可保护83%的小鼠免于致死性的腹腔感染［11］。有研究将 PAO1 的藻酸盐、LPS、白喉毒素3 种组分结合制备多糖结合疫苗，与LPS 和白喉毒素合成的双组分对照疫苗相比，可在小鼠体内产生更高水平的抗体（P< 0.01）［12］。

1.3 OMV OMV 是一种直径为20 ~ 250 nm 的囊泡样结构，是革兰阴性菌在生长过程中分泌的。OMV包含了细菌中几乎所有的生物成分，如肽聚糖、磷脂、LPS、蛋白等［44］。有研究报道，将从铜绿假单胞菌中分离出的OMV 与磷酸铝佐剂联用肌肉注射免疫小鼠，能保护90%的小鼠免于致死剂量的铜绿假单胞菌肺部感染，且具有异血清型交叉保护作用［13］。OMV 具有独特的疫苗递呈方式，可通过膜融合被免疫细胞吞噬，免疫递送能力较强，同时又具有细菌几乎全部成分，因此可作为铜绿假单胞菌研发的重要方向。

2 重组亚单位疫苗

2.1 鞭毛蛋白 鞭毛作为细菌运动的主要器官，其长度可达到甚至超过菌体长度，可作为一种重要的抗原，鞭毛的主要构成成分为FliC 蛋白。TANOMAND 等［14］利用大肠埃希菌表达纯化重组鞭毛蛋白FliC 与ETA 后制备的重组蛋白，在体外显示出与患者血清的高亲和力。有文献报道了一种重组鞭毛-OMP 疫苗（fliCa，b-oprF-oprI），将其免疫小鼠能明显清除肺部感染的铜绿假单胞菌［15］。还有研究者研发了一种蛋白联合疫苗，包含重组肺炎克雷伯菌O-多糖和铜绿假单胞菌鞭毛蛋白，过继转移该疫苗的抗血清，可提高烧伤合并铜绿假单胞菌感染小鼠的存活率［16］。BEHROUZ 等［17］评估了重组 b 型鞭毛蛋白疫苗在小鼠体内的免疫原性，发现该疫苗可显著提高体液免疫及细胞免疫水平，能够降低小鼠肝脏细菌荷载量，在烧伤脓毒症小鼠模型中具有85.7%的保护率。

一项Ⅱ期临床试验中，20 名健康受试者经肌肉注射鞭毛蛋白疫苗，免疫后2 周血清及肺泡灌洗液中的特异性抗体滴度显著升高，在Ⅲ期临床试验CF患者中观察到，接种疫苗组与安慰剂组比较死亡率降低了4.5%，但两组的发病率无显著差异［18-19］。研究结果提示，以鞭毛蛋白作为靶点虽然能产生特异性抗体，但对细菌清除无显著效力，未显著改善患者发病率。可能是鞭毛为细菌非必需结构导致。在自然状态下，铜绿假单胞菌存在有鞭毛和无鞭毛两种细菌亚型，且鞭毛脱落后并不会导致细菌死亡。无鞭毛的细菌增殖分裂产生的新个体可根据环境需要选择产生鞭毛或不产生鞭毛，因此鞭毛蛋白疫苗在抵御无鞭毛细菌感染时效力降低。

2.2 菌毛蛋白 菌毛是铜绿假单胞菌的主要黏附因子，通过菌毛黏附至宿主细胞上。Ⅳ型菌毛（type Ⅳpili，T4P）是一个多聚的、无分支的丝状结构，由数千个相同的PilA 蛋白单体组成。研究者尝试利用重组菌毛蛋白PilA 制备疫苗，发现经鼻腔黏膜免疫小鼠诱导的血清抗体具有调理吞噬作用［20］。KORPI等［21］通过将PliA 和b 型鞭毛蛋白进行混合免疫小鼠，免疫后烧伤小鼠细菌荷载量降低。也有研究从铜绿假单胞菌PA1244 分离Pilin 免疫小鼠，可产生高滴度的特异性抗体水平，在小鼠急性肺炎模型和烧伤模型中均显示出保护效力［22］。结果提示，菌毛蛋白可能是铜绿假单胞菌疫苗研发的重要靶点。另外，需要考虑的是，菌毛抗原在血清学上是异质性的，可分为5 个不同的系统发育类群，因此针对菌毛的疫苗研发过程尚需要解决交叉保护的问题。

2.3 OMP 铜绿假单胞菌外膜上有许多蛋白，这些蛋白对维持细胞结构、渗透压、物质交换、信息传递等具有重要作用，其中外膜孔蛋白OprF 和OprI 是研究较多的靶点。OprF ／ I 疫苗（又名 IC43）目前已完成Ⅲ期临床试验。在Ⅰ期临床试验中，肌肉注射IC43 在健康人群中能够诱导特异性抗体［23］；在Ⅱ期临床试验中，IC43 组感染率与安慰剂组相比无显著差异［24］；在Ⅲ期临床试验中，IC43 在机械通气重症监护室（intensive Care Unit，ICU）患者中耐受性良好，能够产生抗原特异性抗体，然而，总体死亡率与安慰剂组无显著差异［25］。以 OprF ／ I 为靶点的 IC43疫苗在Ⅲ期临床试验中未显示出较好的免疫保护效力，由于适应症选择过重，进入ICU 的患者本身免疫系统可能已经存在极大缺陷，这样的受试者再接受疫苗免疫并不能产生良好的免疫效果。OMP 作为重要靶标的可能，还需进一步研究。有研究者利用OprH进行小鼠鼻内免疫，发现在铜绿假单胞菌菌株PA14肺部攻毒后有40%的保护效力［26］。另外，铜绿假单胞菌还有许多重要的OMP，如Opr86（BamA）、OprD、OprQ、OpdQ 等，均对细菌具有重要的作用，是潜在的疫苗靶点。同时，多抗原联合的多价疫苗可能是最有希望的重组亚单位疫苗。

2.4 毒力因子 铜绿假单胞菌可产生多种毒力因子，其中Ⅲ型分泌系统（T3SS）是产生这些毒力因子的重要分泌通道。T3SS 的原件包括PopB、PopD 和PcrV。PopB ／ PopD 在宿主细胞上形成孔道。有研究发现，PopB 鼻腔黏膜免疫小鼠后能保护小鼠免受致死剂量的铜绿假单胞菌株PAO1 诱导的肺部感染［27］。有研究设计将OMP 与Ⅲ型分泌系统的靶点蛋白联用，旨在获得更高的疫苗保护效力。FAKOOR等［28］将大肠埃希菌表达的 OprF ／ OprI ／ PcrV 重组蛋白疫苗组，与单独的OMP OprF 或OprI 免疫组相比，该重组蛋白疫苗免疫的烧伤小鼠体现出更好的内脏细菌清除能力。

ETA 是铜绿假单胞菌重要的毒力因子之一。有研究发现，使用分离柱纯化制备的PA103 ETA 疫苗，能保护烧伤小鼠抵抗铜绿假单胞菌PA103 的攻击［29］。弹性蛋白酶和碱性蛋白酶是铜绿假单胞菌破坏宿主免疫系统的重要毒力因子。有研究利用福尔马林处理蛋白酶类毒素与弹性酶类毒素制备的疫苗，对铜绿假单胞菌诱导的水貂出血性肺炎［30］、小鼠角膜溃疡［31］和小鼠烧伤［32］均具有保护作用。SOKOL 等［33］将弹性蛋白酶多肽与破伤风类毒素偶联合成疫苗，用该疫苗免疫大鼠后可降低铜绿假单胞菌诱导的肺部感染的细菌荷载量。

综上所述，毒力因子作为铜绿假单胞菌疫苗重要靶标，不仅可降低细菌定殖，还可在细菌感染过程中产生中和毒素的中和抗体，降低细菌对机体的损伤。但大多数毒力因子属于分泌型蛋白，细菌产生后即脱离了菌体，因此该类抗原作为疫苗仍需联合菌体抗原，才能达到更佳的免疫保护效果。

3 灭活疫苗

一种命名为Pseudostat®的口服铜绿假单胞菌疫苗，是利用甲醛灭活技术制备的冻干灭活疫苗，该疫苗在Ⅰ期临床试验中表现出较好的免疫原性和安全性［34］，但试验因未知原因暂停。

有研究利用射线作为灭活手段制备全菌体灭活疫苗，如γ 射线被用于制备布鲁菌和利什曼原虫疫苗在小鼠体内诱导了有效的免疫保护［45-46］。相较于γ 射线，X 射线灭活技术可能是未来全菌体 ／ 全病毒灭活疫苗的主要技术手段。γ 射线来源于原子核的衰变或裂变，存在较大放射污染风险，而X 射线可由电子加速产生，无污染残留，安全性高且成本低廉，两者均还处在早期技术开发阶段。

本课题组报道过一种X 射线灭活的铜绿假单胞菌疫苗，其能够调动细胞免疫，保护小鼠免受肺部致死剂量的感染，交叉保护异血清菌株的挑战，对临床碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌和多药耐药绿假单胞菌均有效［35］。X 射线通过高能射线破坏细菌核酸，使其失去增殖能力，达到灭活细菌的同时，最大限度的保护了菌体抗原结构完整性，是较有希望的全菌体／全病毒灭活方式。进一步研究发现，X 射线辐照铜绿假单胞菌可产生大量含细菌核酸的外膜囊泡［47］。释放的核酸物质能够激活树突细胞的cGAS-STING通路，促进小鼠产生免疫记忆（数据未发表）。利用X射线研发灭活疫苗中需重点探索辐照对菌体的影响因素和机理，不断完善最佳剂量。

全菌体灭活疫苗灭活技术亟需推陈出新，传统热灭活、化学灭活等方式均在灭活细菌 ／ 病毒的同时破坏了疫苗重要的抗原结构，这可能是传统疫苗异血清型交叉覆盖弱的重要原因。

4 减毒活疫苗

LóPEZ-SILES 等［36］通过缺失 PAO1 基因组的芳香族氨基酸合成基因aroA构建了减毒活疫苗PAO1△aroA。研究结果显示，在小鼠角膜感染模型中，主动免疫PAO1△aroA，或过继兔抗PAO1△aroA血清可预防异血清型铜绿假单胞菌引起的角膜感染。虽然减毒活疫苗提示有较好的免疫效果，但实验数据较少，有待进一步研究。

相对于其他技术路线的疫苗，减毒活疫苗最大程度上模拟病原体自然感染激发免疫反应，是最具应用潜质的疫苗。但其在菌种筛选、减毒株构建方面具有较大难度，往往毒力越弱的毒株，其免疫原性、保护效力也就越弱。同时减毒株存在返祖即毒力恢复的现象，需要较长时间的遗传稳定性考察。由于疫苗为活菌，对于免疫力低下人群免疫接种存在安全风险，同时对临床接种操作要求较高。因此，由于上述原因，减毒活疫苗难以成功。

5 细菌载体疫苗

减毒沙门菌常作为细菌疫苗载体，在一项减毒沙门菌表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF ／ OprI 疫苗的Ⅰ期临床试验中，健康志愿者分别通过肌肉、鼻内和口服方式接种疫苗，免疫后血清抗体滴度均显著升高，下呼吸道抗体仅在鼻内和口服免疫组显著升高［37］。该研究结果与重组亚单位疫苗IC43 研究结果基本一致，但缺乏更深入的研究数据。

6 腺病毒载体疫苗

腺病毒载体被广泛应用于重组疫苗研究，该疫苗使用腺病毒递送病原体抗原片段以激发免疫反应，诱导机体产生强大的细胞免疫和体液免疫反应［48］。有研究者制备了表达OprF 的腺病毒疫苗（AdOprF.RGD.Epi8），该疫苗在小鼠致死肺炎模型中诱导了强的抗OprF 的细胞免疫和保护性免疫［38］。

腺病毒载体疫苗研发需要考虑如下问题：①抗原选择。铜绿假单胞菌抗原复杂，需选择主要的免疫保护抗原；②疫苗安全性。需注意接种腺病毒载体疫苗后可能出现严重不良反应；③预存免疫。人群中普遍存在针对人源腺病毒的抗体，可显著降低该类疫苗的免疫原性，通常需要使用抗原修饰和非人源腺病毒载体来避免预存免疫反应。有研究者通过将OprF 的B 细胞表位整合至腺病毒的hexon 高变区，重复免疫小鼠来增强目标蛋白特异性细胞和体液免疫反应［39］。另外，人腺病毒的类型一般为Ad5 型，有研究者提出用非人灵长类腺病毒载体AdC7 来代替Ad5 作为载体来解决预存免疫的问题［38］。

7 结论与展望

迄今为止，虽然有许多疫苗已进行了临床试验或还处于临床前研究阶段，但尚无产品上市。以上研究结果提示，单一组分的靶点恐难有效预防或清除铜绿假单胞菌感染。同时也表明，铜绿假单胞菌疫苗研发面临的主要问题在于尚无理想靶点进行疫苗设计，分析其原因在于：①铜绿假单胞菌的基因组庞大，因此具有强大的环境适应能力，可在浮游状态和生物膜状态之间转换，其中生物膜的形成可帮助其逃避免疫监视，同时铜绿假单胞菌也具有多种毒力分泌机制，能够破坏免疫系统，为疫苗靶点的选择带来了困难；②缺乏理想的动物评价模型，如多为慢性阻塞性肺病患者、CF 患者、ICU 患者和免疫缺陷患者等发生铜绿假单胞菌感染，而临床前研究阶段多采用健康的动物模型，不能充分评价病理状态下疫苗的保护效力；③缺乏异血清型交叉保护，从现有研究来看，部分候选疫苗目前缺乏足够的异血清型临床分离株的效力保护观察；④临床适应症的选择。选择过于严重的临床适应症，会导致疫苗保护效果评价不够客观；⑤临床方案的实施。现有临床诊断技术难以精确判定铜绿假单胞菌的早期感染和定植，给受试者入组、排除标准以及疫苗保护效力评价带来困扰。

针对上述问题，一个可能的疫苗设计思路为：从工艺上，研发并采用新的技术，制备尽可能覆盖细菌多种有效抗原物质的综合性疫苗，如全菌体疫苗、组分疫苗、多价疫苗等。同时，还需进一步深入了解铜绿假单胞菌的分子发病机制，充分利用基因组学、蛋白质组学和反向疫苗学等新技术手段，开发多抗原联合疫苗、组分疫苗或新一代灭活全菌体疫苗。在临床适应症选择、临床方案设计、临床效力评价指标方面，还应充分考虑可能导致疫苗失败的风险，做好风险控制，提高疫苗成功的可行性。随着各个领域研究的不断深入，一定会研发出安全有效的铜绿假单胞菌疫苗，填补市场空白。