轮状病毒微滴数字PCR 检测方法的建立、优化、验证及应用

尚丛珊，孟婷婷，侯亚妮，李元，刘利兵

西安培华学院医学院，陕西西安710125

病原体感染是引起儿童急性腹泻和重症腹泻的主要原因，如轮状病毒（rotavirus，RV）［1］、诺如病毒（Norovirus，NoV）［2］、人星状病毒（human astrovirus，HAstV）［3］、札如病毒（Sap virus，SaV）［4］、腺病毒（adenoviruses，AdV）［5］等，其中 RV 是引起成人及儿童腹泻的常见病毒。RV 是一种RNA 病毒，基因组为双链RNA，由11 段基因组成，分别编码6 种结构蛋白（VP1 ~ 4、VP6 和 VP7）和 6 种非结构蛋白（NSP1 ~ 6）［6-7］。根据 VP6 抗原蛋白结构不同，可分为 A~J 共 9 个群，只有 A、B 和 C 群 RV 可感染人类，且在人和动物中均有发现，A 群RV 一般不感染成人，但其是感染婴幼儿的主要病原体［8-9］，目前尚无特效药。

RV 诊断常用的检测方法主要有电镜观察、ELISA 法、胶体金法、核酸杂交法及实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法等［10］。微滴数字 PCR（RT-ddPCR）法不依赖标准曲线，属于终点检测，不受扩增循环阈值的影响，定量结果更精确，对PCR 抑制剂更耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势［11-12］。目前PCR 检测RV 体系主要以VP6、VP7 及NSP3 基因作为毒株的靶标，但在RT-ddPCR 检测体系的应用鲜见报道。非结构蛋白NSP5 为重要的胞质磷蛋白，RV 感染细胞后，NSP5 在胞质内表达并参与形成病毒池结构，调控RV 的复制和包装，NSP5 基因相对其他基因段具有高度保守的氨基酸序列［13-14］。因此，本研究建立一种基于NSP5 基因A组RV 的RT-ddPCR 检测方法，以期用于RV 的临床快速检测。

1 材料与方法

1.1 样本 临床样本来源于西安市儿童医院2018—2019 年门诊病例中5 岁以下腹泻患儿的粪便标本，共150 份（胶体金检测RV 阳性98 份，阴性52 份，阳性率为65.3%）。

1.2 细胞、质粒及病毒 MA104 细胞及质粒pEGFP-N2购自宝生物工程（大连）有限公司；A 组RV 由西安交通大学医学院微生物学实验室从阳性粪便样本中分离、鉴定和保存，NoV（基因型 GⅠ）、Adv（基因型 F4l 型）、HAstV（HAstV-1 型）及 SaV（GⅠ基因型）由该实验室保存。

1.3 主要试剂及仪器 Trizol 提取试剂及Super-Script®Ⅲ Platinum®One-Step Quantitative RT-PCR System 购自美国 Invitrogen 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自德国 QIAGEN 公司；Dynabeads ®mRNA Purification Kit 购自美国 Life Technology 公司；7900-HT Fast 实时荧光 PCR 仪购自美国ABI 公司；一步法 RT-ddPCR 试剂盒、QX200 Droplet Digital PCR System 购自美国BIO-RAD 公司。

1.4 引物与探针的设计及合成 根据GenBank 中登录的A 组人RV 毒株NSP5 基因序列（KJ748475.1），应用MEGA3.1 软件进行同源性比对，选择NSP5 高度保守基因区域，通过软件Primer 5.0 设计引物和探针，上游引物 NSP5-F：5′-AAGACAAATGCAGACGCTGG-3′，下游引物 NSP5-R：5′-TGATGGTCGTGATTGCGTTG-3′，荧光探针 NSP5-P：5′-FAM-TCTGATTCTGCTTCAAACGATCCA-BHQ-3′。引物及探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5 标准物质的制备 用PBS 将1 份阳性粪便样本稀释为 10%悬液，2 634 ×g离心 10 min，保留上清液，按mRNA Purification Kit 说明书提取RV 的RNA，根据 ISO 指南 35：2006［15］要求，制备 RV 的RNA 标准物质，确定该标准物质的特性值为（4.9 ±1.3）× 107copies ／ μL，-80 ℃保存。

1.6 方法的建立 将提取RV 的RNA 模板或RNA标准物质按RT-ddPCR 试剂盒说明书配制反应体系，共 20 μL（包含引物、探针、RV 的 RNA 模板），并生成微滴，加入96 孔板中，进行RT-ddPCR 扩增。反应条件为：60 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，共40 个循环；退火 1 min，共 40 个循环；98 ℃ 10 min；4 ℃保持，反应温度升降速率<2.5 ℃／s。反应结束后将96 孔板放入QX200 Droplet Digital PCR system，仪器自动采集荧光信号，采用软件Quanta Soft 读取RNA 的 copies。

1.7 方法的优化

1.7.1 RT-ddPCR 的退火温度 按1.6 项方法检测RNA 核酸标准物质，退火温度分别设为55.1、56.0、57.2、58.1、58.9、59.9、61.0、62.1、63.2、64.1、64.9 ℃，引物浓度为 100 nmol ／ L，探针浓度为60 nmol ／ L。试验重复3 次，取平均值。导出各温度下微滴数数据，应用Excel 软件绘制直方图，进一步验证退火温度可靠性。

1.7.2 RT-ddPCR 的引物及探针浓度 按1.6 项方法检测RNA 核酸标准物质，退火温度为61.0 ℃，引物浓度分别设为 40、60、100、120 nmol ／ L，探针浓度分别设为 60、70、80、90、100 nmol ／ L，采用矩阵法筛选引物和探针的最佳浓度。

1.8 方法的验证

1.8.1 引物及探针特异性 按1.5 项方法提取RV、NoV、HAstV、Adv 及 SaV 的 RNA，采用优化的 RT-ddPCR法进行检测，验证引物及探针的特异性。

1.8.2 线性范围 将RNA 核酸标准物质进行102、103、104、105、5 × 105、106、5 × 106、107梯度稀释，每个稀释倍数的理论浓度分别为490 000、49 000、4 900、490、245、49、24.5 及 4.9 copies ／ μL，采用优化的RT-ddPCR 法进行检测。以理论值为横坐标，检测值为纵坐标，绘制标准曲线。同时进行RT-qPCR 检测，引物和探针序列同1.4 项，反应条件为：50 ℃ 60 min; 95 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，共 40 个循环；55 ~ 65 ℃ 1 min，共 40 个循环；98 ℃，10 min；4 ℃ 保持。以检测值为横坐标，理论值对数为纵坐标，绘制标准曲线。

1.8.3 灵敏性及重复性 将RNA 核酸标准物质进行 102、103、104、105、5 × 105、106、5 × 106、107、5 ×107梯度稀释，每个稀释倍数的理论浓度分别为490 000、49 000、4 900、490、245、49、24.5、4.9 及2.45 copies ／ μL，采用优化的 RT-ddPCR 及 RT-qPCR（同1.8.2 项）法进行检测，每个稀释浓度重复检测4 次，计算各梯度检测结果的相对标准偏差（RSD）。

1.9 方法的初步应用 按1.4 项方法提取2018 —2019 年收集的150 份腹泻患儿的粪便样本的RNA，分别采用优化的RT-ddPCR 法及RT-qPCR 法（同1.8.2 项）进行检测，比较两种方法的符合率。

2 结 果

2.1 方法的优化

2.1.1 最适RT-ddPCR 退火温度 退火温度在55 ~65 ℃区间内检测标准物质拷贝数的平均值分别为260、250、245、245、260、263、289、280、261、268 及260 copies ／ μL，阳性及阴性微滴可显著分成两簇。温度为61.0 及62.1℃时，阳性与阴性微滴两簇中间弥散微滴数目较少，表明扩增结果良好；退火温度为61.0 ℃时拷贝数最高，即61.0 ℃时扩增结果优于62.1 ℃。退火温度 < 59.9 及 > 63.0 ℃时，阳性和阴性微滴两簇中间弥散微滴数目较多，扩增结果较差。见图1。因此确定最佳的退火温度为61.0 ℃。61.0 ℃时 RT-ddPCR 检测 RV 直方图中，两个峰（阳性峰和阴性峰）显著分开中间无干扰，微滴数量及质量较好，表明RT-ddPCR 在该退火温度下检测RV 病毒数量可靠性较高。见图2。

图1 退火温度对RT-ddPCR 检测结果的影响Fig.1 Effect of annealing temperature on detection result by RT-ddPCR

图2 不同退火温度RT-ddPCR 法检测RV 的直方图Fig.2 Histograms of RV detection by RT-ddPCR at various annealing temperatures

2.1.2 最适RT-ddPCR 的引物及探针浓度 引物及探针浓度分别为 100 和 60 nmol ／ L 时，阳性荧光信号最强、阴性液滴荧光与阳性液滴荧光可显著分开，且阳性液滴生成的数量最高，见图3。因此，确定最佳引物及探针浓度分别为100 和60 nmol ／ L。

图3 不同引物及探针浓度对RT-ddPCR 检测结果的影响Fig.3 Effect of primer and probe concentrations on detection result by RT-ddPCR

2.2 方法的验证

2.2.1 引物及探针特异性 RV 检测有阳性微滴生成，其他4 种病毒均无阳性液滴生成，且RV 阳性微滴簇与阴性微滴簇可显著分开，微滴簇之间弥散微滴较少，见图4。表明设计的引物及探针特异性良好。

图4 引物和探针特异性的验证结果Fig.4 Verification for specificity of primer and probe

2.2.2 线性范围 RNA 核酸标准物质理论拷贝数过大（490 000 copies／μL）时，RT-ddPCR 法无法检出，但RT-qPCR 可检出；当理论拷贝数为4.9 copies／μL时，两种方法均可检出，理论值与检测值基本保持一致。RT-ddPCR 及RT-qPCR 法分别在4.95 ~49 000 即 4.95~490 000 copies ／μL 范围内，与检测值呈良好的线性关系；线性方程分别为y=1.100 0x-44.257 0 和y= 0.185 4x- 0.112 2，R2分别为1.000 0 和 0.997 2，见图 5。表明 RT-qPCR 法比 RT-ddPCR 法的检测范围广。

图5 A 群 RV RT-ddPCR（A）和RT-qPCR（B）检测方法的线性关系Fig.5 Linear relationship of RT-ddPCR（A）and RT-qPCR（B）for detection of groups A RV

2.2.3 灵敏性及重复性 RNA 核酸标准物质理论拷贝数过大（490 000 copies ／ μL）时，RT-ddPCR 法无法检出；RT-qPCR 可检出，RSD为 4.68，但Ct过低，为12.15；当拷理论贝数达 4.9 copies／μL 时，RT-ddPCR法的RSD略高于 RT-qPCR 法，但 RT-qPCR 的Ct过大，表明此时RT-qPCR 法扩增效率可能较低；其他浓度两种方法检测的RSD分别为1.75% ~ 5.24%和0.34% ~ 4.68%。两种方法最低检测稀释倍数均为 5 × 107，即检测最低拷贝数为 2.45 copies ／ μL。见图 6、表 1 和表 2。

图6 不同稀释浓度对RT-ddPCR 检测结果的影响Fig.6 Effect of dilution factor on detection result by RT-ddPCR

表1 A 群RV RT-ddPCR 检测法的灵敏性和重复性验证结果Tab.1 Verification for reproducibility and sensitivity of RT-ddPCR for detection of group A RV

表2 A 群RV RT-qPCR 检测法的灵敏性和重复性验证结果Tab.2 Verification for reproducibility and sensitivity of RT-qPCR for detection of group A RV

2.3 方法的初步应用 RT-ddPCR 和RT-qPCR 法检测150 份腹泻患儿的粪便样本，98 份为RV 阳性，52 份阴性，与胶体金检测结果一致，两种方法的符合率100%。表明RT-ddPCR 法可用于RV 的临床快速检测。

3 讨 论

VP6、VP7 及NSP3 基因序列是目前用来建立PCR 检测方法常用的靶标［16-17］，VP6 基因序列保守，但也有突变的发生。NSP3 体系建立的引物与探针对于某些物种RV（如鼠）NSP3 基因序列一致性较低［17］。MAES 等［18］研究表明，A 组 RV 中，H 基因型的 NSP5基因序列在不同物种的RV 中同源性（＞91%）高于其他基因分型。曾渊君等［17］研究比较了常见RV 不同基因型的NSP5 基因序列，其一致性高于NSP3，达83.70%，表明NSP5 相对于NSP3 更为保守，可成为建立A 组RV 检测体系中理想靶标。因此本研究基于A 组RV NSP5 基因序列设计了1 组引物和探针，建立了RT-ddPCR 检测方法，检测引起儿童腹泻相关病毒，包括 NoV、AdV、RV、HAstV 及 SaV，结果表明，该组引物及探针具有较强的特异性（100%）。RT-ddPCR是PCR 技术中的一种，将20 μL 的模板采用油包水的方式分割成20 000 个小液滴，每个小液滴在PCR中反应后，逐一通过检测器，根据阳性与阴性微滴的比例可直接计算目标分子的拷贝数，从而实现对目标分子的绝对定量［19-20］。相对 RT-qPCR 法，RT-ddPCR法无需核酸标准品，也不需建立标准曲线，可直接绝对定量，同时又具有RT-qPCR 的优点。CAVE等［21］在检测 RT-ddPCR 和 RT-qPCR 的灵敏度时发现，RT-ddPCR 灵敏度是 RT-qPCR 的 100 倍，检测限可达 2.45 copies ／ μL。但 RT-ddPCR 检测上限不如RT-qPCR 可靠，需要对高浓度的目标分子稀释到一定拷贝数以下［22］。这是由于两种检测方式对荧光信号的阅读过程不同造成的，RT-ddPCR 是对反应终点的微滴中荧光信号进行阅读，而RT-qPCR 是实时检测荧光信号的变化，两种检测方法原理相同。

本研究对RT-ddPCR 的退火温度及探针、引物浓度进行了优化，结果表明，最适退火温度为61.0 ℃，最佳引物及探针浓度分别为100 和60 nmol ／ L。本研究方法验证结果表明，RNA 核算标准物质理论拷贝数过大（490 000 copies ／μL）时，RT-ddPCR 法无法检出，但 RT-qPCR 可检出；当拷贝数为 4.9 copies ／ μL时，两种方法均可检出，理论值与检测值基本保持一致。RT-ddPCR 及RT-qPCR 法分别在4.95~49 000即 4.95 ~ 490 000 copies ／ μL 范围内，与检测值呈良好的线性关系，线性方程分别为y= 1.100 0x-44.257 0 和y=0.185 4x-0.112 2，R2分别为 1.000 0和0.997 2。RT-ddPCR 的线性相关系数比RT-qPCR略优，但RSD比RT-qPCR 略高，表明其重复性比RT-qPCR 略差。ZHAO 等［23］通过 RT-ddPCR 和 RT-qPCR法检测副痘病毒的结果与本研究基本一致。YANG等［24］对 RT-ddPCR 和 RT-qPCR 检测性能进行研究，结果表明，RT-ddPCR 在检测灵敏度和准确率方面略高于RT-qPCR 法，而稳定性和重复性比RT-qPCR法略差，两种方法采用不同的引物和探针，可影响研究结果。另有研究表明，在检测艾滋病病毒时，RT-qPCR 的线性关系、灵敏度和准确性均优于RT-ddPCR 法［25］。采用 RT-ddPCR 和 RT-qPCR 法检测150 份腹泻患儿的粪便样本中，98 份为RV 阳性，52份阴性，与胶体金检测结果一致，两种方法的符合率100%。

综上所述，本研究建立并优化了RV 的RT-ddPCR检测方法，该方法具有良好的特异性及精密性，与RT-qPCR 法符合率为100%，可用于RV 的临床快速检测。