重组H5N1 流感血凝素杆状病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

吴清胜，吴相英，姚春萍，李媛媛，

1.国药中生生物技术研究院有限公司，北京101111；2.北京生物制品研究所有限责任公司，北京100176

杆状病毒表达载体系统（baculovirus expressionvector system，BEVS）是以杆状病毒为外源基因载体，以昆虫细胞为受体的一种真核表达系统，具有效率高、容量大、表达产物能进行折叠和修饰等特点［1-3］。自20 世纪80 年代建立以来，BEVS 已经发展为成熟的生物制品生产平台，有多种产品获批，包括兽用疫苗、人用疫苗及治疗产品［4-8］。杆状病毒不会刺激哺乳动物产生强烈的免疫应答，也不会对其造成功能性损伤，这些特性使其成为一种极具应用前景的基因治疗载体［9］。无论是疫苗研发，还是基因治疗［10-11］，杆状病毒滴度的快速、准确检测均至关重要，荧光定量PCR（qPCR）法具有操作简单、灵敏度高、耗时短等优点［12-14］。本文通过设计H5 基因的引物及探针，以Bacmid-H5 重组质粒为标准模板，对PCR 的退火温度及引物浓度进行优化，建立了检测H5 基因拷贝数的qPCR 法，并对该方法的专属性、重复性进行验证，确定线性范围及检测限，并应用该方法和免疫荧光法［15］对H5 杆状病毒连续传代4 次及连续培养0 ～6 d 的样品进行检测。

1 材料与方法

1.1 菌株、病毒及细胞 含重组rBacmid-H5 的E.coli菌株DH10Bac 由国药中生研究院有限责任公司第七研究室制备，重组H5 杆状病毒、重组H1 杆状病毒、未重组杆状病毒均由该室制备；Sf9 昆虫细胞购自ATCC。

1.2 主要试剂及仪器 SFX-Insect 培养基购自美国GE 公司；EASY Dilution（for Real Time PCR）、Probe qPCR Mix 购自日本TaKaRa 公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；LB Brothready to use 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；DNeasy®Blood&Tissue Kit 购自德国 QIAGEN 公司；StepOnePlus Real-time PCR System 购自美国ABI公司；Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白测定仪购自德国Eppendorf 公司。

1.3 引物及探针 H5 基因上游引物（HA-F）：5′-tac gcc gct gac aag gaa ag-3′，下游引物（HA-R）：5′-ggt cca cac gtc cag gaa ac-3′；Tanqman 荧光探针：5′-act cag aag gcc atc gac ggc gtg ac-3′。均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 标准模板的制备 将rBacmid-H5 重组菌接种至含三抗（卡那霉素、庆大霉素、四环素终浓度分别为 50、7、10 μg ／ mL）的 LB 液体培养基中，37 ℃培养过夜；12 000 ×g离心 5 min，收集菌体；无内毒素质粒大提试剂盒提取重组质粒Bacmid-H5，充分混匀，利用Eppendorf BioPhotometer D30 核酸蛋白测定仪进行检测，按公式①计算质粒浓度，将Bacmid-HA 重组质粒的碱基数4 007 bp 代入公式②得出copies。分装冻存于-20 ℃。

1.5 方法的建立

1.5.1 退火温度优化 以提取的质粒 rBacmid-H5 为标准模板，（53 ± 5）℃为退火温度，进行梯度PCR 扩增，扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。最亮的电泳条带所对应的退火温度为最佳退火温度。

1.5.2 引物浓度优化 根据线性范围，在高浓度模板（8.5 × 109copies ／ μL）和适中浓度模板（2.3 ×106copies／μL）下，分别加入0.5、1、2、3μL 的10mmol ／ L引物进行qPCR 扩增。选取Ct值最低（荧光值最高）的引物浓度为最佳引物浓度。

1.6 方法的验证

1.6.1 专属性 将反应体系确定为25 μL，包括10 μmol／L 的上、下游引物、探针各 1 μL，模板 1 μL，Probe qPCR Mix（2 ×）12.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，注射用水 8 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 个循环；72 ℃ 10 min。

以10 倍系列稀释的rBacmid-H5 质粒为模板绘制标准曲线，以相同提取方法制备的重组H5 杆状病毒的基因组DNA 为待检样品，以EASY Dilution稀释液为空白对照，验证方法的专属性。以重组H5杆状病毒基因为阳性对照，PBS 为阴性对照，qPCR法检测重组H1 杆状病毒和未重组的杆状病毒基因组DNA，重复2 次，进行进一步验证。

1.6.2 线性范围及检测限 用EASY Dilution 对模板进行稀释，扩大浓度范围（7.36 × 10-3～ 8.5 ×109copies ／ μL），进行 qPCR 检测，确定线性范围及检测限。

1.6.3 重复性 将重组H5 杆状病毒于27℃，120r／min摇瓶培养3 d；接种至传代后1 d 的Sf9 细胞（活细胞密度为 1.86 × 106cells ／ mL，活率为 98.92%），取培养3 d 后的细胞（活细胞密度为1.77×106cells／mL，活率为47.62%）进行检测。在线性范围内，将2.3×109copies ／ μL（即 10 μg ／ mL）的模板 10 倍稀释至2.3 × 103copies ／ μL，绘制标准曲线，使用 qPCR 法进行检测，重复6 次。

1.7 方法的初步应用 采用qPCR 法对重组H5 杆状病毒连续传代4 次［培养3 d 左右（活率约50%）传代，病毒与细胞体积比为1︰10］及连续培养0 ～6 d 的样品进行检测，并与免疫荧光法进行比较［15］。

2 结 果

2.1 标准模板 rBacmid-H5 质粒浓度为 37.5 μg／mL，拷贝数为 8.536 1 × 109copies ／ μL。

2.2 方法的建立

2.2.1 退火温度 退火温度在48.8 ～57.2 ℃（中点为53 ℃）范围内，均可见目的扩增条带。根据目的条带深浅，并结合引物的Tm 值，选取55 ℃为最佳退火温度。见图1。

图1 温度梯度PCR 产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of temperature gradient PCR product

2.2.2 引物浓度 适中浓度模板时，加入0.5、1、2和3 μL 的引物，Ct值差异不明显；高浓度模板时，加入 1 μL 的引物，Ct值较低，见图 2 和表 1。因此，最佳引物使用量确定为 1 μL 10 mmol ／ L 引物。

图2 不同浓度引物的定量PCR 反应荧光强度曲线Fig.2 Fluorescent intensity curve of qPCR at various primer concentrations

表1 两种模板浓度下不同浓度引物的Ct 值Tab.1 Ct values of primers at different concentrations using templates at two concentrations

2.3 方法的验证

2.3.1 专属性 qPCR 法检测重组H1 及未重组的杆状病毒（不含外源基因），均无荧光信号，见表2。表明该方法特异性良好，不与未重组的杆状病毒和流感病毒的其他亚型发生交叉反应。

表2 不同亚型重组流感杆状病毒qPCR 法检测结果Tab.2 Detection results of recombinant baculovirus with influnenza virus of different subtypes by qPCR

2.3.2 线性范围及检测限 模板浓度在1.15×103～4.25× 109copies／μL 之间，线性关系良好，R2=0.999，见图 3。模板浓度低于 1.15 × 103copies ／ μL，偏离线性范围，检测值与阴性对照区分不明显。见表3。确定检测限为 1.15 × 103copies ／ μL。

图3 线性范围及检测限的试验数据图Fig.3 Experimental data graph of linear range and detection limit

表3 线性范围及检测限的确定Tab.3 Determination of linear range and detection limit

2.3.3 重复性 重组H5 杆状病毒培养3 d，重复检测6 次，RSD为1.01%，见表4，表明重复性良好。

表4 重复性验证Tab.4 Validation for reproducibility

2.4 方法的初步应用 H5 杆状病毒连续传代4 次，病毒滴度保持相对稳定，qPCR 法的检测值高于免疫荧光法，见表5；H5 病毒连续培养0 ～6 d，病毒滴度在第3 天达到较高值，qPCR 法的检测值高于免疫荧光法，见表6。

表5 H5 杆状病毒连续传代 4 次的病毒滴度（copies ／ mL）Tab.5 Detection results of titer of H5 baculovirus subcultured for four passages（copies ／ mL）

表6 H5 杆状病毒连续培养 0 ～ 6 d 的病毒滴度（copies ／ mL）Tab.6 Detection results of titer of H5 baculovirus cultured for 0 ～ 6 d（copies ／ mL）

3 讨 论

重组杆状病毒在昆虫细胞中连续传代培养过程中可能会丢失目的基因，产生缺陷干扰病毒（defective interfering particles，DIs）［16-18］，导致外源蛋白的表达量显著降低［19］。应用Bac-to-Bac 技术构建的重组杆状病毒，遗传不稳定性更加明显［20］。这些缺陷颗粒的产生和不断积累，会严重影响目的蛋白的产量［21］。本研究建立的qPCR 方法，能够特异性的检测H5 基因。该方法通过检测外源基因得到定量结果，为有效的重组病毒含量，避免了缺陷性病毒颗粒对检测值的干扰。

测定杆状病毒滴度的方法主要有蚀斑法、终点稀释法、免疫染色法、流式细胞术法、实时定量荧光PCR 法（real-time qPCR）等。基于核酸的检测和免疫测定方法是病毒检测常用的方法。免疫染色法或免疫荧光染色法，在培养3 d 后，再包括加入一抗、二抗等多个步骤，每步操作均可能对滴度检测值产生影响。实际检测中，形成的荧光斑点大小不一，经常存在多个斑点聚集的大斑点，而且需要劳动强度较大的人工显微镜下斑点计数，由于对斑点的取舍以及可能存在多计或者漏记，因此人为读数误差较大；此外，检测中，还发现滴度与细胞代次或细胞状态有一定关系，这也是重复性较差的因素之一。

疫苗的生产过程中，一般需对病毒滴度进行快速检测，或对培养过程中，病毒滴度的变化进行监测。免疫荧光法耗时较长，而qPCR 法具有快速检测的优势，对于工艺的稳定性控制具有重要意义。qPCR 法检测的为基因copies，如果待检样品中存在缺陷病毒或者死病毒，检测值将会偏高；在实际应用中，qPCR 法可作为快速检测方法进行应用，满足时效性要求，而准确的滴度值可再应用其他方法进行复检（蚀斑法或免疫法）。然而，对于特定产品，在成熟工艺或者GMP 生产条件下，培养参数、保存条件和保存时间相对固定，病毒的活力会相对稳定，批间差异小，基因拷贝数与病毒活力之间的关系或者比值较为固定，qPCR 法检测的参考意义将更大。