胎盘特异蛋白8 的理化性质及其分子结构分析

刘建兵 ，李文龙 ，蔡芳芳 ，崔小华 ，郝建卿 ，师如意 ，林晓雨 ，李莉

1.山西医科大学基础医学院医学细胞生物与遗传学教研室，山西太原030001；2.山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室，山西太原030001；3.山西医科大学基础医学院，山西太原030001

生物信息学是由生物学和计算机科学组成的一门新的交叉学科。该学科研究开发的生物信息学软件可用来分析核酸的序列信息以及蛋白的理化性质、空间结构等。

胎盘特异蛋白8（placenta-specific protein 8，PLAC8）是在人树突状细胞中最先被发现［1］，由于其功能尚未被鉴定，也曾被叫作ONZIN。GALAVIZHERNANDEZ 等［2］应用多种实验方法研究发现，ONZIN 在小鼠胎盘滋养层细胞中特异表达，进一步通过cDNA 克隆技术以及基因组序列比对后，将ONZIN 更名为PLAC8。在人胎盘的研究中，PLAC8仅在母胎界面的间质绒毛滋养层细胞（interstitalextravillous trophoblast cells，iEVTs）中特异性表达，并可促进绒毛膜外滋养层细胞（extravillous trophoblast cells，EVTs）的迁移和侵袭行为［3］。此外，在骨髓、淋巴样细胞、肺和肠的上皮细胞中，一些学者也观察到PLAC8 的表达［4］，并且 PLAC8 可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭等细胞行为，参与肿瘤的发展，如肺癌［5］、前列腺癌［6］和肝癌［7］等。由此可见，PLAC8 参与了细胞行为的调控，特别是胎盘发育中滋养细胞功能的调节，并且与疾病的发生发展有关。但目前对PLAC8的研究较少，其功能及作用机制并不完全清楚。因此，本研究应用多种生物信息学软件对人PLAC8 的理化性质、结构、功能及蛋白相互作用等进行分析，为进一步研究PLAC8 的功能及其作用机制提供新的思路和方向，以期促进相关疾病的深入研究。

1 材料与方法

1.1 PLAC8 序列 在 National Center for Biotechnology Information（NCBI）［8］网站（https：／ ／ www.ncbi.nlm.nih.gov ／ protein ／ AAH12205.1）获得 PLAC8 的氨基酸序列信息，GenBank 登录号：AAH12205.1。

1.2 PLAC8 理化性质分析 通过ProtParam 和Protscale 软件［9］分别进行 PLAC8 理化性质及亲疏水性分析。蛋白亲疏水性由亲水区和疏水区面积大小决定。

1.3 PLAC8 的信号肽结构分析 通过SignalP 4.1 Server［10］进行 PLAC8 信号肽结构分析。 判断标准：S 平均值是否高于0.500；C 值用来寻找剪切位点；Y值为综合S 和C 值之后的一个评价标准。

1.4 PLAC8 的跨膜结构分析 通过TMHMM Server v.2.0［11］进行 PLAC8 跨膜区域分析。

1.5 PLAC8 亚细胞定位分析 通过 PSORTⅡ［11］进行PLAC8 亚细胞定位分析。

1.6 PLAC8 二级结构和结构域分析 通过SOPMA软件［12］进行PLAC8 二级结构分析；通过Conserved Domain 数据库进行PLAC8 结构域分析。

1.7 PLAC8 蛋白翻译后位点修饰分析 通过NetNGlyc 1.0 Sever［13］对 PLAC8 的 N-糖基化位点进行分析；通过 YinOYang 1.2 Server［14］对 PLAC8 的 O-糖基化位点进行分析；通过Netphos 2.0 Server 工具［15］对PLAC8 的磷酸化位点进行分析。

1.8 PLAC8 相互作用蛋白预测 通过STRING 数据库［16］寻找与PLAC8 相互作用的蛋白并构建蛋白互作网络，设置为高置信度0.9，数量少于10。

1.9 PLAC8 系统进化树构建 从NCBI 数据库中获取人、黑猩猩、鼠、羊、野猪、壁虎、家猫、猕猴和家兔的 PLAC8 序列。通过 MEGA-X 软件［17］进行序列比对和建树，序列比对选择Align by ClustalW，进化树构建选择邻近法。

2 结 果

2.1 PLAC8 的理化性质 ProtParam 软件分析结果显示，PLAC8 相对分子质量为12 440.52，分子式为 C524H832N154O157S22，理论等电点（PI）= 7.34。组成PLAC8 的氨基酸有20 种，其中含量最高的为半胱氨酸（13.9%），含量最少的分别为色氨酸、谷氨酸、赖氨酸和组氨酸，仅0.9%，见图1。PLAC8 的不稳定指数为38.99；亲水性平均总值为0.125，脂肪指数为57.65。

图1 PLAC8 的氨基酸组成分析Fig.1 Analysis of amino acid composition of PLAC8

ProtScale 软件分析结果显示，PLAC8 整体的亲水性区大于疏水性区。其中，疏水性最大的为第43位甘氨酸，分值为2.222；亲水性最大的为第107 位酪氨酸，分值为-2.533，见图2。

图2 PLAC8 的亲疏水性分析Fig.2 Hydrophilic-hydrophobic analysis of PLAC8

2.2 PLAC8 的信号肽结构 SignalP 4.1 Server 分析结果显示，C 和Y 的最大值均是位于第52 位的半胱氨酸，分值分别为0.128 和0.157；S 的最大值是位于第45 位的苯丙氨酸，分值为0.274。此外，第1 ~ 51 位氨基酸的 S 和 D 的均值均为 0.156。S 的平均值小于0.5，因此，PLAC8 不具有信号肽序列，也不是经典的分泌型蛋白。见图3。

图3 PLAC8 的信号肽分析Fig.3 Analysis of signal peptides of PLAC8

2.3 PLAC8 的跨膜结构 TMHMM Server 2.0 分析结果显示，PLAC8 有115 个氨基酸序列，均位于膜内区，可知为胞内蛋白，不具有跨膜区，见图4。

图4 PLAC8 跨膜结构分析Fig.4 Analysis of trans-membrane domain of PLAC8

2.4 PLAC8 的亚细胞定位 PSORTⅡ分析结果显示，PLAC8 定位于不同细胞器的可能性分别为细胞外基质（44.4%）、细胞质（33.3%）、液泡（11.1%）和细胞核（11.1%）。

2.5 PLAC8 二级结构和高级结构 SOPMA 软件分析结果显示，PLAC8 由47%的α 螺旋、15%的延伸链、10%的β 转角和43%的无规则卷曲组成，见图5。其中，延伸链即氨基酸组成的肽链，α 螺旋和β 转角为蛋白质常见的二级结构。α 螺旋指多肽链主链围绕中心轴呈有规律的螺旋式上升，β 转角是简单的非重复性结构。Conserved Domain 数据库分析结果显示，PLAC8 为PLAC8 超家族成员，该结构域由77个氨基酸残基组成，见图6。

图5 PLAC8 的二级结构分析Fig.5 Analysis of secondary structure of PLAC8

图6 PLAC8 的功能结构域分析Fig.6 Analysis of functional domain of PLAC8

2.6 PLAC8 翻译后位点修饰 NetNGlyc 1.0 Sever、YinOYang 1.2 Server 和 Netphos 2.0 Server 预测分析结果显示，PLAC8 不存在N-糖基化位点；O-糖基化位点分别位于第11、98 和114 位的苏氨酸以及第24 和105 位的丝氨酸位点；磷酸化位点分别位于第83 和105 位的丝氨酸位点、第72 位的苏氨酸位点以及第78 和88 位的酪氨酸位点。

2.7 PLAC8 的相互作用蛋白 STRING 数据库检索结果显示，构成PLAC8 蛋白相互作用网络的蛋白有10 个，分别为中性粒细胞弹性蛋白酶（elastase，neutrophil expressed，ELANE；score：0.913）、组蛋白酶 G（cathepsin G，CTSG；score：0.913）、组蛋白酶（cathepsin G，CTSC；score：0.910）、细胞凋亡相关斑点样蛋白（PYD and CARD domain containing，PYCARD；score：0.910）、溶菌酶（lysozyme，LYZ；score：0.908）、人髓细胞核分化抗原（myeloid cell nuclear differentiation antigen，MNDA；score：0.907）、unc-13 同系物D（unc-13 homolog D，UNC13D；score：0.906）、补体C3（complement C3，C3；score：0.906）、核糖核酸酶家族成员 2（ribonuclease A family member 2，RNASE2；score：0.906）、丝裂原活化蛋白激酶 1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1；score：0.905）。见图 7。

图7 PLAC8 的蛋白相互作用网络Fig.7 Protein-protein interaction network of PLAC8

2.8 PLAC8 多重序列比对和进化关系 MEGA-X软件构建的进化树显示，人PLAC8 蛋白序列与黑猩猩相似度最高，与家兔相似度最低。表明在物种进化过程中，PLAC8 始终有保守结构域存在，这与Conserved Domain 数据库的预测结果相一致。见图8。

图8 PLAC8 的分子进化树Fig.8 Phylogenetic tree of PLAC8

3 讨 论

PLAC8 位于人基因组4q13 ~ 4q21，包含5 个外显子［2］。蛋白质在细胞内合成后，需运输至特定的位置才能发挥其功能。PLAC8 定位于不同细胞器的可能性分别为细胞外基质（44.4%）、细胞质（33.3%）、液泡（11.1%）、细胞核（11.1%）。本研究发现，PLAC8是胞内蛋白，表明其非经典的分泌性蛋白，但其主要在细胞外基质中发挥功能，提示PLAC8 可能通过胞吐的方式运输至细胞外。

糖基化和磷酸化修饰是真核生物内广泛存在的重要的翻译后修饰方式，能够调控细胞增殖、信号传递以及基因的表达等，疾病的发生常常与关键分子的异常修饰存在密切关联［18］。本研究发现，PLAC8不存在N-糖基化位点；在第11、98 和114 位的苏氨酸以及第24 和105 位的丝氨酸位点存在O-糖基化位点；在第83 和105 位的丝氨酸位点、第72 位的苏氨酸位点以及第78 和88 位的酪氨酸位点存在磷酸化位点。这些修饰位点的发现、鉴定及功能研究，将有利于探索PLAC8 在细胞增殖、凋亡、免疫等生物过程中的作用机理。

蛋白互作是蛋白分子行使功能的重要方式［18］。构建蛋白互作网络能够发现与目标蛋白分子相互作用的蛋白分子，这将为进一步研究其功能机理提供依据。本研究构建的PLAC8 蛋白相互作用网络显示，PLAC8 蛋白可能与10 个蛋白具有相互作用，其中包括 ELANE、CTSG、CTSC、PYCARD、LYZ、MNDA、UNC13D、C3、RNASE2、MAPK1。已有文献报道，ELANE 能够调控自然杀伤细胞、单核细胞和粒细胞的功能［19］；CTSG 可增强血管内皮细胞的通透性［20］，并且可对多种免疫和炎症途径进行调控［21］；在细胞凋亡和炎症中，PYCARD 可促进caspase 介导的凋亡，可能以细胞类型特异性方式参与激活线粒体凋亡途径［22］；LYZ 可增强免疫制剂的活性并且具有溶菌的功能［23］；MNDA 可在骨髓增生异常综合征中调节细胞凋亡［24］；UNC13D 在淋巴细胞毒性颗粒胞吐中起作用，在免疫突触处进行颗粒成熟、颗粒对接和启动［25］；C3 可激活 JAK2 ／ STAT3 途径，从而参与到胃癌的进展［26］；在结直肠癌细胞侵袭行为研究中，PLAC8 通过介导MAPK1 信号通路的增强，促进细胞的侵袭［27］。由此可见，PLAC8 可能与该网络中的下游蛋白分子相互作用，参与细胞增殖、凋亡、分化等过程及肿瘤的调控。但这些结论仍需相应的实验进一步验证。

本研究利用生物信息学方法对PLAC8 进行的分析表明，PLAC8 是一种碱性、稳定的亲水性蛋白，主要在细胞外基质发挥作用，属于PLAC8 超家族的成员；有多个O-糖基化和磷酸化位点；能够与多个蛋白形成互作网络。这些结果将对进一步研究PLAC8功能及其作用机制提供新的科学依据。