森林脑炎灭活疫苗（地鼠肾细胞）细胞工厂培养工艺的建立

张朔，赵建，邹墅，张颖，赵东山，刘晓杰，刘玥，翟东颖，孙宏亮

1.长春生物制品研究所有限责任公司，吉林长春130012；2.吉林省药品检验所，吉林长春130033

森林脑炎是由森林脑炎病毒引起的一种以侵袭中枢神经系统为主的急性病毒性传染病［1］，该病目前尚无特异的治疗方法，病死率3% ～30%［2-3］。接种疫苗是控制该病流行的最经济有效的措施［4］。传统的转瓶培养工艺制备森林脑炎灭活疫苗存在难以克服的缺陷，主要包括地鼠用量相对较大，不符合关于实验动物使用的减少、替代及循环使用原则（即3R 原则）；转瓶使用数量多，具有人工劳动强度大，自动化程度低，效率相对较低，占用空间大，可控制性差，污染风险较高等缺点［5］。而细胞工厂用于大规模的细胞培养，可大量减少地鼠用量，具有空间培养面积大因而占地较小等优点，可达到在有限空间内提高产能、减少人工操作工作量、降低污染风险的目的，同时细胞工厂表面经过特殊处理，可确保细胞黏附和生长的最佳条件［6-7］。

本研究采用细胞工厂培养原代地鼠肾细胞收获病毒液，经超滤浓缩、灭活、纯化后制备了森林脑炎灭活疫苗，建立连续培养多次收获工艺，以提高疫苗产量。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级金黄地鼠，雌性，体重13 ~16 g，日龄12 ~ 14 d，由长春生物制品研究所有限责任公司动物室提供，动物合格证号：201600014430。

1.2 病毒 工作种子森林脑炎病毒森“张”株，第10代，由长春生物制品研究所有限责任公司疫苗三室保存并提供。

1.3 主要试剂及仪器 MEM 培养基（干粉）购自美国Hycolone 公司；199 培养基（干粉）购自美国GIBCO公司；牛血清白蛋白ELISA 检测试剂盒购自无锡博生医用生物技术开发有限公司；乳酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；葡萄糖检测试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司；新生牛血清购自太原润生生物材料有限公司；细胞工厂购自美国Corning公司，型号 10 ／ 40 层；Sepharose 4FF 凝胶过滤介质购自美国GE Healthcare 公司；截留相对分子质量300 kD 的超滤膜包购自美国Millipore 公司。

1.4 溶液配制 消化液：将0.5%胰蛋白酶用MEM按照终浓度为0.125%进行稀释，经7.5% NaHCO3溶液调 pH 至 7.8 ～ 8.2，同时按终浓度 100 IU ／ mL补加硫酸卡那霉素。细胞生长液：在含0.2%乳白蛋白水解物、1%谷氨酰胺的MEM 液中，按终浓度6%加入新生牛血清，并用7.5% NaHCO3溶液调pH 至6.8 ～ 7.2，按终浓度 100 IU ／ mL 补加硫酸卡那霉素。病毒维持液：含1% ~ 2%新生牛血清的199 培养液，用 NaHCO3溶液调 pH 至 7.4 ～ 7.8。

1.5 地鼠用量及接种病毒时间确定 分别取120（3对肾 ／ 层）、140（3.5 对肾 ／ 层）、160（4 对肾 ／ 层）、180（4.5 对肾 ／ 层）及 200 只（5 对肾 ／ 层）地鼠，无菌取肾，于2 ～8 ℃消化18 ～20 h；各组分别接种4个10 层细胞工厂，生长液200 mL ／层，（37 ± 1）℃静置培养；分别于接种后24、48、68 及72 h 观察细胞生长状态，并按下式计算细胞覆盖率，确定最适地鼠数量及接种病毒时间［8］。每个10 层细胞工厂为1 批。

1.6 病毒收获时间及次数确定

1.6.1 细胞工厂实验组（工厂01 ~ 05） 取160 只地鼠为 1 个解剖组，共 5 组，无菌取肾，于 2 ～ 8 ℃消化18 ～20 h；各组均接种1 个40 层细胞工厂，（37 ± 1）℃静置培养68 ～72 h；待细胞长成致密单层后，按 0.5 MOI 感染森林脑炎病毒，（33 ± 1）℃静置培养96 h；进行第1 次收获，收获后补加维持液，（33 ± 1）℃静置培养 48 h；进行第 2 次收获，如此反复进行10 次收获，至细胞明显脱落后停止收获［9-10］。取样检测上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量。病毒毒力检测按照《中国药典》三部（2015 版）各论森林脑炎灭活疫苗2.2.3.2 中方法进行；葡萄糖、乳酸含量检测按试剂盒说明书进行。

1.6.2 10 L 转瓶对照组（转瓶01） 取100 只地鼠，无菌取肾，于 2 ～ 8 ℃消化 18 ～ 20 h；接种 5 个 10 L转瓶，加入细胞生长液 2 L ／ 瓶，（37 ± 0.5）℃培养68 ～72 h；待细胞长成致密单层后，按0.5 MOI 感染森林脑炎病毒，加入病毒维持液 2 L ／ 瓶，（33 ±1）℃培养96 h；进行第1 次收获，补加病毒维持液2 L ／ 瓶，（33 ± 1）℃培养 48 h［9-10］，进行第 2 次收获，共收获4 次，至细胞明显脱落后停止收获。取样，检测上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量，方法同1.6.1 项。

1.7 编码主要保护性抗原核酸的遗传稳定性检测 将细胞工厂实验组第10 次收获的病毒液作为毒种重新按照0.5 MOI 感染已经长成致密单层的原代地鼠肾细胞，（33 ± 1）℃恒温室培养96 h 后收获上清液，即第11 代，如此反复传至第20 代。对第11~20代收获后的病毒液抽提RNA，用反转录试剂盒反转录合成cDNA，以其为模板，利用3 对引物（见表1，由库美生物科技有限公司合成）。PCR 扩增E 蛋白片段。反应条件为：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min，94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，共 30 个循环；72 ℃ 1 min；4 ℃保存。将扩增后的主要保护性抗原E 蛋白送库美生物科技有限公司进行测序，分析各代次编码主要保护性抗原的核酸变异情况。

表1 PCR 扩增用引物Tab.1 Primers for PCR

1.8 原液制备及检定 分别将3 批40 层细胞工厂（批号：工厂 01 ~ 03）和1 批 10 L 转瓶（批号：转瓶01）收获的病毒液用相同方法制备疫苗原液［9，11］：合并检定合格的同一细胞批生产的单次病毒收获液，经连续流离心去细胞碎片（转速：700 ～1 000×g，流速：1 500 ～ 2 500 mL ／ min），上清液加入终溶度为 500 μg ／ mL 的甲醛 2 ~ 8 ℃灭活 21 d。用截留相对分子质量300 kD 膜包超滤浓缩40 ～60 倍后，采用柱色谱法进行纯化，色谱介质为Sepharose 4FF凝胶柱，每次上样量为柱床体积的5% ～7%，洗脱液为 0.01 mol ／ L PBS，线性流速为 20 ～ 30 cm ／ h，检测波长为280 nm。收集第1 峰的洗脱液即为纯化后的病毒液，经除菌过滤后，即为疫苗原液。按照《中国药典》三部（2015 版）进行抗原含量、蛋白质含量、地鼠肾细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残余量检测。抗原含量不低于1 ∶232，蛋白质含量不高于80 μg ／ mL，地鼠肾细胞蛋白质残留量不高于12 μg ／ mL，牛血清蛋白残留量不高于 50 ng ／ mL。

2 结 果

2.1 最适地鼠用量及接种病毒时间 结果表明，接种相同对地鼠肾时，4 批细胞工厂之间细胞生长状态一致，培养时间越长，细胞生长越致密。在相同培养时间时，接种地鼠肾对数与细胞生长状况不呈线性相关。培养24 和48 h 时，细胞均不能长成致密单层，至72 h 左右时，每个消化批使用140 ~ 200 对地鼠肾（3.5 ～ 5 对肾 ／ 层）时，细胞均可长成致密单层。见图1。综合考虑细胞生长情况及实验动物利用率后，确定每个消化批使用140 ~ 180 对地鼠肾（3.5 ～ 4.5 对肾 ／ 层），培养时间为 68 ～ 72 h。

图1 细胞工厂不同接种数量细胞生长状态Fig.1 Growth of cells at various inoculation amounts in cell factory

2.2 病毒收获时间及次数 细胞工厂实验组收获10 次后，细胞出现脱落，停止收获，第10 次毒力低于《中国药典》三部（2015 版）标准（即病毒滴度不低于 7.0 lgLD50／ mL），但前 5 次收获的病毒液葡萄糖及乳酸含量变化较稳定；10 L 转瓶对照组收获4 次后，细胞出现明显脱落，停止收获。见图2 和图3。

图2 不同培养方式制备的森林脑炎病毒收获液的病毒滴度Fig.2 Titers of harvested TBE virus cultured by different methods

图3 不同培养方式制备的森林脑炎病毒收获液液中葡萄糖（A）及乳酸（B）含量Fig.3 Glucose（A）and lactic acid（B）contents in harvested TBE virus cultured by different methods

测序结果表明，除第11、12 及13 次收获液的1 260位出现突变，第15、19 及20 次收获液的608 位出现突变外，其他各代次收获液均无突变。其中，编码主要保护区第1 260 位的突变导致碱基由A 突变为C，但由于密码子简并性，这种改变并未使其编码的氨基酸发生改变，均为编码Leu。编码主要保护区第608位的突变导致碱基由A 突变为C，编码的氨基酸也由终止密码子突变为Cys，但均未改变蛋白的性质。

结合收获液病毒毒力变化情况、葡萄糖含量变化情况、乳酸含量变化情况、编码主要保护性抗原的核酸变异情况，细胞工厂实验组可进行3 ～5 次病毒收获。

2.3 原液检定结果 原液中抗原含量、蛋白质含量、地鼠肾细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残余量均符合《中国药典》三部（2015 版）规定，见表2。根据前期使用地鼠数量摸索，采用细胞工厂工艺每批地鼠投产量可减少40%，仍能够确保病毒收获液及原液生产体积不变。

表2 两种工艺制备疫苗原液检定结果Tab.2 Control tests on bulks of vaccine prepared by two processes

3 讨 论

本文结合转瓶工艺使用40 层细胞工厂培养原代地鼠肾细胞和森林脑炎病毒，确定了细胞工厂制备森林脑炎灭活疫苗（地鼠肾细胞）的工艺参数：细胞工厂最适细胞接种量为3 ~ 4 对地鼠肾 ／ 层；感染病毒96 h 后第1 次收获，之后每48 h 收获1 次，可连续收获3 ~ 5 次。

将森林脑炎病毒液加入终溶度为500 μg ／ mL的甲醛2 ~ 8 ℃灭活21 d，通过截留相对分子质量300 kD 的膜包进行超滤浓缩后，经Sepharose 4FF柱层析纯化后得到疫苗原液，其抗原含量、牛血清白蛋白残留量、地鼠肾细胞蛋白残留量均符合《中国药典》三部（2015 版）要求［11］。

杨睿［12］在《贾第虫GeRF1 识别终止密码子性质分析》一文中指出，Paramecium、Tetrahymena 和Stylonychia 将通用终止密码子UAA 和UAG 翻译为谷氨酸酰胺，将UGA 识别为终止密码。Euplotes 中UAA 和UAG 作为终止密码子，而通用终止密码子UGA 翻译成半胱氨酸。由此推测第608 位由于碱基突变造成终止密码子突变成了半胱氨酸密码子，该突变并未改变蛋白的性质，突变前终止密码子和突变后半胱氨酸密码子表达的氨基酸均为半胱氨酸。因此，从遗传稳定性方面，采用细胞工厂培养方式连续收获10 代病毒液对E 蛋白无影响。对多次收获的病毒液进行测序，结果显示，连续多次收获并未改变森林脑炎病毒包膜蛋白E 的活性，表明森林脑炎病毒传代后遗传稳定性良好。

利用细胞工厂培养原代地鼠肾细胞制备森林脑炎灭活疫苗，条件易于控制，能大量节约地鼠用量和劳动成本，有效减少污染几率，获得较高的细胞密度并收获高毒力的病毒液，可替代转瓶大规模生产森林脑炎灭活疫苗［13-15］。