铁皮石斛多糖提取工艺

林君，何秋杰，赵琤，黄友琴*

广西农业职业技术学院（南宁 530007）

铁皮石斛属多年生附生草本植物[1]，是我国传统的珍稀药材，名列“中华九大仙草”之首[2]。现研究证实，铁皮石斛具有滋阴润肺、养胃生津、健脑明目等神奇功效[3]，可用于治疗热病津伤、口干烦渴、阴虚火旺等多种病症[4]。

铁皮石斛主要含多糖、生物碱、氨基酸和微量元素等化学成分[5]，其中多糖含量相较其他石斛属植物更高，是生物体内一类重要有机高分子化合物[6]，是维持生命活动的四大基础物质之一[7]。我国对多糖的研究起步较晚，始于20世纪70年代，但发展迅速，并成为现代药理学研究的新热点[8]。铁皮石斛多糖有多种提取方法，如水提法和酶解法。水提法是最常用的方法，而酶解法因酶对铁皮石斛中游离蛋白质具有水解作用，提取液中只含少量蛋白质，同时降低了它们与原料的结合力，有利于多糖的浸出，所以酶解法也是一种理想的提取方法[9-10]。

采取水提法和酶解法2种方法提取铁皮石斛多糖，考察提取时间、提取温度和料液比等多因素对多糖获得率的影响，得到多糖的最佳提取工艺，为铁皮石斛多糖的开发和利用提供参考，对于带动铁皮石斛深加工产业的发展、拓宽其利用途径、增加其附加值、提高经济效益、带动农民致富具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄糖（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；苯酚（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；浓硫酸（优级纯）；所有分离用有机溶剂均为国产分析纯。

可见分光光度计（VIS-7220N，北京瑞利分析仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HHS，江苏省金坛市医疗仪器厂）；电子天平（PL203，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；快速超声波提取器（GDYQ-705S，长春吉大小天鹅仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9246，上海精宏实验设备有限公司）；电热恒温水浴锅（HWS-24，上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 铁皮石斛多糖提取工艺

铁皮石斛→清洗→烘干→粉碎→浸提

1.2.2 操作要点铁皮石斛清洗：选取无病虫害、无机械伤、无腐败变质的新鲜铁皮石斛，用清水洗干净，去除表面的污物及杂质。

烘干：将洗干净的铁皮石斛用80 ℃温度进行烘干。

粉碎：烘干的铁皮石斛切成小段，用粉碎机粉碎，用0.180 mm孔径筛过筛成铁皮石斛粉末。

浸提：把铁皮石斛粉末用不同的料液比、不同的浸提温度、不同的浸提时间进行浸提。

1.2.3 硫酸-苯酚法测定铁皮石斛多糖

1.2.3.1 配制标准葡萄糖溶液

准确称取1 g干燥至恒重的葡萄糖，用蒸馏水定容至1 000 mL，摇匀后吸取10 mL用蒸馏水稀释定容至250 mL，该溶液每毫升相当于含0.04 mg葡萄糖。

1.2.3.2 制作葡萄糖标准曲线

分别吸取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6和1.8 mL标准葡萄糖（0.04 mg/mL）溶液于比色管，加蒸馏水至2.0 mL，加入1.0 mL 6%苯酚及5.0 mL浓硫酸，摇匀冷却，沸水浴显色15 min后于490 nm波长测定其吸光度，得葡萄糖标准曲线，葡萄糖溶液质量浓度与吸光度的线性关系为y=14.824x-0.002 2（R2=0.999 7）。

图1 葡萄糖标准曲线

1.2.3.3 多糖提取率的计算

称取3 g铁皮石斛粉末于100 mL容量瓶中浸提，过滤得过滤液，吸取5 mL过滤液于100 mL容量瓶中定容，吸取1 mL样品溶液于试管中，加入1.0 mL蒸馏水，再加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度。与葡萄糖标准曲线比较算出多糖含量。采用称重法测定铁皮石斛多糖的提取率[9]，按式（1）计算。

2 结果与分析

2.1 水浸提法提取铁皮石斛多糖单因素试验

2.1.1 不同浸提温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

称取3 g铁皮石斛粉末，各5份，加水溶解定容至100 mL容量瓶中，分别在50，60，70，80和90 ℃的水浴锅中恒温加热4 h，冷却后过滤，吸取5 mL过滤液放入100 mL容量瓶中稀释定容，吸取1 mL样品稀释溶液于试管中，依次加入1.0 mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度，与标准葡萄糖比较算出不同浸提温度提取铁皮石斛多糖的提取率，结果见表1。

表1 不同浸提温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

由图2可看出，浸提温度50~80 ℃时铁皮石斛多糖提取率随温度升高而增大，超过80 ℃后，随着温度升高，提取率又呈缓慢下降的趋势，分析其原因可能是温度过低时，其对多糖物质的析出不利，温度过高时，析出的多糖又会在高温情况下降解。故最佳浸提温度为80 ℃，此时铁皮石斛多糖提取率为2.3%。

图2 不同浸提温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

2.1.2 不同料液比浸提对铁皮石斛多糖提取率的影响

称取3 g铁皮石斛粉末，各5份，分别以1∶20，1∶25，1∶30，1∶35和1∶40（g/mL）的料液比在80℃水浴锅中恒温加热浸提4.5 h，冷却后过滤，吸取5 mL过滤液于100 mL容量瓶中稀释定容，吸取1 mL样品稀释液于试管中，依次加入1.0 mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度，与标准葡萄糖比较算出不同料液比提取铁皮石斛多糖的提取率，结果见表2。

表2 不同料液比提取对铁皮石斛多糖提取率的影响

由图3可看出，随着料液比中加水量增大，铁皮石斛多糖提取率呈上升趋势，但超过1∶35（g/mL）时，提取率呈下降趋势。故1∶35（g/mL）为最佳的浸提料液比，此时铁皮石斛多糖提取率为2.2%。

图3 不同料液比提取对铁皮石斛多糖提取率的影响

2.1.3 不同浸提时间对铁皮石斛多糖提取率的影响

称取3 g铁皮石斛粉末，各5份，温度80 ℃，料液比1∶35（g/mL），分别浸提3.5，4.0，4.5，5.0和5.5 h，冷却后过滤，吸取5 mL过滤液放入100 mL容量瓶中稀释定容，吸取1 mL样品稀释溶液于试管中，依次加入1.0 mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度，与标准葡萄糖比较算出不同浸取时间提取铁皮石斛多糖的提取率，结果见表3。

表3 不同提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响

由图4可看出，在3.5~4.5 h时，随提取时间延长，铁皮石斛多糖提取率逐渐升高，但4.5 h之后又逐渐下降，在一定时间范围内，多糖提取率会随着时间延长而提高，但多糖成分已完全溶出后，继续延长提取时间，并不能提高提取率，反会有增加提取液中杂质含量的可能性。故提取时间选择4.5 h，此时铁皮石斛多糖提取率为3.5%。

图4 不同提取时间对铁皮石斛多糖提取率的影响

2.2 水浸提法提取铁皮石斛多糖正交试验

在单因素试验的基础上，选取温度、时间和料液比进行三因素三水平正交试验，结果见表4和表5。

表4 正交试验表L9(33)

由表5可知，试验结果表明不同的因素对提取率均有影响，其中3个因素对多糖提取率影响最大的是提取时间，其次是料液比，提取温度的影响最小。从试验结果看来，以提取率为指标，确定最佳提取工艺条件A1B1C3，即提取时间4 h、提取温度70 ℃、料液比1∶40（g/mL），此条件下铁皮石斛多糖提取率可达2.7%。在上述试验结果中与最佳提取率相近的是试验2。

表5 L9(33)正交试验结果

2.3 酶（果胶酶）解法提取铁皮石斛多糖单因素试验

2.3.1 不同酶解温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

称取5份1 g铁皮石斛粉末，溶解定容至100 mL容量瓶中，分别在30，40，50，60和70 ℃水浴锅中恒温加热4 h，冷却后过滤，吸取10 mL过滤液放入100 mL容量瓶中稀释定容，吸取1 mL于试管中，依次加入1.0 mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度，与标准葡萄糖比较算出铁皮石斛多糖的提取率，结果见表6和图5。

表6 不同酶解温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

由图5可知，酶解温度30~50 ℃时，提取率呈上升趋势，达到50 ℃时，提取率最高，60~70 ℃时提取率逐渐下降，温度过高时，其对多糖的析出可能受影响，酶也会失活。故多糖提取最适的温度为50 ℃，此时提取率为2.7%。

图5 不同酶解温度对铁皮石斛多糖提取率的影响

2.3.2 不同酶解时间对铁皮石斛多糖提取率的影响

称取5份1 g铁皮石斛粉末，溶解定容至100 mL容量瓶中，以温度50 ℃，酶解时间分别为2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 h，在水浴锅中恒温加热进行浸提，拿出冷却过滤，吸取10 mL过滤液放入100 mL容量瓶中稀释定容，吸取1 mL样品溶液于试管中，依次加入1.0 mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度，与标准葡萄糖比较算出铁皮石斛多糖的提取率，结果见表7和图6。

表7 不同酶解时间对铁皮石斛多糖提取率的影响

由图6可知，酶解时间2.0~3.5 h时，多糖提取率不断增高，达到最高点时，提取率又开始逐渐呈下降趋势，所以在一定时间范围内，多糖会随着时间延长而提高，多糖完全溶出后，继续增加提取时间，可能会增加提取液中杂质含量的可能性。故最适酶解时间为3.5 h，此时提取率为2.8%。

图6 不同酶解时间对铁皮石斛多糖提取率的影响

2.3.3 不同酶用量对铁皮石斛多糖提取率的影响

称取1 g铁皮石斛粉末，各5份，于100 mL容量瓶中，酶用量分别为0.04%，0.05%，0.06%，0.07%和0.08%，加水定容后在50 ℃水浴锅中恒温加热浸提3.5 h，冷却后过滤，吸取10 mL过滤液放入100 mL容量瓶中稀释定容，吸取1 mL样品溶液于试管中，依次加入1.0mL蒸馏水，1 mL 6%苯酚溶液和5 mL浓硫酸溶液，显色测其吸光度，与标准葡萄糖比较算出铁皮石斛多糖的提取率，结果见表8和图7。

表8 不同酶用量对铁皮石斛多糖提取率的影响

图7 酶解法酶用量对多糖提取率的影响

由图7可知，酶用量0.04%~0.07%时，铁皮石斛多糖提取率呈上升趋势，酶用量达到0.07%时，铁皮石斛多糖的提取率最高，酶用量达到0.07%之后，铁皮石斛多糖提取率又开始逐渐下降，故最适酶用量为0.07%，此时提取率达2.4%。

2.4 酶提法提取铁皮石斛多糖正交试验

在单因素试验基础上，选取酶用量、酶解温度和酶解时间进行三因素三水平正交试验，结果见表9和表10。

表9 正交试验表L9(33)

由表10可知，不同因素对提取率均有影响，其中3个因素对多糖提取率影响最大的是酶用量，其次是酶解温度，影响最小的是酶解时间，在试验结果中以提取率为指标，确定最佳提取工艺条件为A1B3C1，即酶用量0.06%、提取温度60 ℃、提取时间3 h，在此最佳条件下铁皮石斛多糖提取率可达2.7%，铁皮石斛多糖的提取率最佳，与最佳组合交相近的试验是试验3。

表10 L9(33)正交试验结果

3 结论

试验结果表明：（1）在水浸提法的单因素试验优化铁皮石斛多糖的提取工艺中，提取时间对铁皮石斛多糖的提取影响最大。应用分析法优化铁皮石斛多糖提取工艺，同时考虑实际生产中的能耗活性保持的问题，通过正交试验得到铁皮石斛多糖提取的最佳工艺参数为提取时间4 h、提取温度70 ℃，料液比1∶40（g/mL），此条件下铁皮石斛多糖提取率最高可达2.7%。（2）在酶解法的单因素试验优化铁皮石斛多糖的提取工艺中，酶用量对铁皮石斛多糖的提取影响最大。通过正交试验得到铁皮石斛多糖提取的最佳工艺参数为酶用量0.06%、提取温度60 ℃、提取时间3 h，此条件下的铁皮石斛多糖提取率最高可达2.7%。（3）由正交试验可知水浸提法与酶解法对铁皮石斛多糖提取最高均可达2.7%，但从省时方面比较，优先使用酶解法。