响应面法优化微波辅助碱法制备壳聚糖工艺

陈蒙，兰孝维，柏韵，常宝贤，张振*，李丹丹*

锦州医科大学（锦州 121000）

壳聚糖被称为可溶性甲壳质，是自然界中存在较多的多糖之一[1-2]，因其安全无毒、生物降解性和成膜性好，且成本较低[3-5]，在食品、发酵、医药、化工等领域应用广泛[6]。壳聚糖是来源于藻类植物、软体动物、昆虫等的甲壳素脱乙酰度大于70%后形成的产物[7-10]。脱乙酰度的高低直接影响壳聚糖的性质及其应用，因此，如何获得高脱乙酰度的壳聚糖至关重要。

甲壳素脱乙酰制备壳聚糖常用的方法包括微生物法、碱法和物理法。其中，微生物法是利用高产甲壳素脱乙酰酶制备壳聚糖的一种方法，该方法有利于环保，但该酶的筛选、分离要求较高的条件，工艺控制复杂，周期较长，限制其在实际生产中的应用[11-12]。碱法是甲壳素脱乙酰的传统工艺方法，氢氧化钠是最常用的碱液。大量研究表明一次浸碱法得到的壳聚糖脱乙酰度较低，多次重复碱液提取可提高壳聚糖的脱乙酰度和黏度，但缺点在于其耗时较长，同时浓碱不利回收，易产生废液，对环境污染较大。常用的物理辅助方法包括超声波法和微波法，研究显示，物理法辅助可将多数化学反应的时间缩短，提高反应效率，减少化学试剂的用量。许庆陵等[11]利用超声辅助碱液法制备的壳聚糖脱乙酰度值可达90%以上。因此，为提高壳聚糖的脱乙酰度、优化壳聚糖制备工艺，以实验室自制的甲壳素为原料，采用微波辅助碱法制备壳聚糖，研究甲壳素颗粒度、微波功率、液料比、碱液质量浓度等因素对脱乙酰度的影响，以期获得制备较高脱乙酰度壳聚糖的最优工艺条件，为壳聚糖工业化生产和应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

1.1.1 试验材料与试剂

甲壳素（自制，以中国对虾虾壳为原料，按照前期实验所得[14]的制备方法制备颗粒大小0.600 mm（30目）的甲壳素）；盐酸、甲基橙、NaOH、苯胺蓝（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.1.2 试验仪器与设备

电热恒温水浴锅（HHS-21-8型，天津市泰斯特仪器有限公司）；分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140型，上海一恒科技有限公司）；紫外可见分光光度计（UV-6300型，上海美谱达仪器有限公司）；高速粉碎机（上海圣科仪器设备有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 壳聚糖的制备工艺

称取10 g甲壳素置于聚四氟烧杯中，按照一定液料比加入NaOH溶液，反应一段时间后，采用磁力搅拌均匀，2 h后将反应物移入微波装置，在不同微波功率条件下反应10 min，冷却，过滤，水冲洗至中性，在105 ℃条件下干燥至恒重，测制备的壳聚糖脱乙酰度及NaOH溶液浓度。

1.2.2 壳聚糖脱乙酰度的测定

称取2份壳聚糖样品，各0.2~0.3 g，其中一份溶解于30 mL 0.01 mol/L标准盐酸溶液中，加入2~3滴甲基橙-苯胺蓝混合指示剂（1∶2，V/V），用0.01 mol/L标准NaOH溶液滴定。另一份壳聚糖样品置于105 ℃烘箱烘干至恒重后，测定水分。按式（1）和（2）计算。

式中：C—NH2为氨基含量；Y为壳聚糖脱乙酰度；A1和A2为HCL标准溶液和NaOH标准溶液浓度，mol/L；V1和V2为HCl标准溶液和NaOH标准溶液体积，mL；M为样品质量，g；W为试样中水分含量；0.016为与1 mL 1 mol/L HCl溶液相当的氨量，g；9.94%为壳聚糖中理论氨基含量。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 碱液质量浓度对壳聚糖脱乙酰度的影响

固定液料比15∶1（mL/g）、微波功率500 W，考察NaOH溶液浓度25 g/100 mL，35 g/100 mL，45 g/100 mL，55 g/100 mL和65 g/100 mL对制备的壳聚糖脱乙酰度的影响。

1.2.3.2 液料比对壳聚糖脱乙酰度的影响

固定NaOH溶液浓度45%、微波功率500 W，考察液料比5∶1，10∶1，15∶1，20∶1和25∶1（mL/g）对制备的壳聚糖脱乙酰度的影响。

1.2.3.3 微波功率对壳聚糖脱乙酰度的影响

固定NaOH溶液浓度45%、液料比15∶1（mL/g），考察微波功率200，300，400，500和600 W对制备的壳聚糖脱乙酰度的影响。

1.2.4 响应面试验设计

依据单因素试验，以碱液质量浓度（A）、液料比（B）、微波功率（C）作为考察因子，壳聚糖脱乙酰度为响应值，设计表1响应面试验。

表1 因素水平设计表

1.2.5 数据处理

采用Excel和SPSS 19.0对数据进行分析，Duncan法进行显著性（p＜0.05），并采用Excel作图，响应面试验设计，分析采用Design-Expert 8.0.6.1软件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碱液质量浓度对所得壳聚糖脱乙酰度的影响

碱液质量浓度变化对制备的壳聚糖脱乙酰度影响如图1所示。碱液质量浓度25 g/100 mL，所得壳聚糖的脱乙酰度仅77.6%，脱乙酰度较低的原因在于NaOH为亲核剂，较低的NaOH浓度与甲壳素分子中乙酰基间产生的亲和力较小，不利于脱乙酰反应的进行。随着碱液质量浓度逐渐升高，壳聚糖脱乙酰度有所增加，当碱液质量浓度达到55 g/100 mL时，所得壳聚糖脱乙酰度最高，为95.8%，之后碱液质量浓度再升高，壳聚糖脱乙酰度反而有所下降。因此碱液质量浓度选择55 g/100 mL。

图1 碱液质量浓度变化对所得壳聚糖脱乙酰度影响

2.1.2 液料比对所得壳聚糖脱乙酰度的影响

液料比变化对所得壳聚糖脱乙酰度影响如图2所示。随着液料比增大，所得壳聚糖的脱乙酰度有所增加。这是因为随着液料比增大，碱液用量增加，甲壳素与碱液混合更均匀，反应更彻底。液料比达到15∶1（mL/g），脱乙酰度达到94.9%，随着液料比增加，所得壳聚糖的脱乙酰度略有升高，但变化并不显著（p＜0.05）。因此，液料比选择15∶1（mL/g）。

图2 液料比变化对所得壳聚糖脱乙酰度影响

2.1.3 微波功率对所得壳聚糖脱乙酰度的影响

微波功率变化对制备的壳聚糖脱乙酰度影响如图3 所示。壳聚糖脱乙酰度随着微波功率增加先升高而后减小，微波功率500 W时，壳聚糖脱乙酰度达到最高，为94.4%。微波辐射作用促进甲壳素脱乙酰反应，但过高的功率使反应过程中液料比发生变化，不利于脱乙酰反应[16]。因此，微波功率选择500 W。

图3 微波功率变化对所得壳聚糖脱乙酰度的影响

2.2 响应面试验结果与验证

2.2.1 响应面试验结果分析

表2 ~表4显示响应面试验结果、方差分析结果及二阶多项式回归模型。方差分析表明F=28.6，p＜0.01，极显著，而失拟项不显著（p=0.975 9＞0.05），相关系数R2为0.980 9，修正系数Radj2为0.946 7，说明方程具有较好拟合度，该模型可靠，可以解释94.67%的响应值变化。因此，该模型可靠，所得方程可用于确定微波辅助碱法制备壳聚糖最优工艺。影响壳聚糖脱乙酰度的因素依次为A（碱液质量浓度）＞B（液料比）＞C（微波功率），其中，A（碱液质量浓度）极显著（p＜0.01），AB，AC具有极显著的交互作用（p＜0.01）。

表2 响应面试验结果

表3 响应面回归方程方差分析表

表4 二阶多项式回归模型分析

2.2.2 响应曲面和等高线分析

响应曲面斜率与响应值变化正相关，而等高线反映2个因素之间的交互作用大小，越接近圆形，交互作用则越弱[16]。图4~图6显示3个因素间的响应曲面和等高线，A（碱液质量浓度）与B（液料比），A（碱液质量浓度）与C（微波功率）交互作用明显，B（液料比）与C（微波功率）等高线轮廓几乎呈圆形，表明液料比与微波功率没有交互影响壳聚糖脱乙酰度。

图4 碱液质量浓度和液料比对壳聚糖脱乙酰度的影响

图6 液料比和微波功率对壳聚糖脱乙酰度的影响

2.2.3 微波辅助碱法制备壳聚糖最佳工艺参数确定

使用Design-Expert 8.0.6.1软件确定微波辅助碱法制备壳聚糖最佳工艺参数：碱液质量浓度58.73 g/100 mL、液料比16.30∶1（mL/g）、微波功率518.69 W，为便于设定，修订参数为碱液质量浓度58 g/100 mL、液料比16∶1（mL/g）、微波功率520 W。在此工艺条件下，壳聚糖脱乙酰度为94.7%，与预测值95.17%接近，表明模型有效，可以预测微波辅助碱法制备壳聚糖脱乙酰度。

图5 碱液质量浓度和微波功率对壳聚糖脱乙酰度的影响

表5 最优工艺条件验证

3 结论

以壳聚糖脱乙酰度为考察指标，通过单因素试验和响应面试验确定微波辅助碱法制备壳聚糖的最佳工艺条件为碱液质量浓度58 g/100 mL、液料比16∶1（mL/g）、微波功率520 W。在此条件下壳聚糖脱乙酰度得到提高，达94.7%，后续可深入研究微波辅助提高壳聚糖脱乙酰度的反应机制。