青钱柳内生真菌次生代谢产物抗氧化活性研究

胡世一 周雅琴,2* 安 宁 石忠衡 赵立春 谭小明，3*

1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西药用植物园，广西 南宁 530023；3.广西优势中成药与民族药开发工程技术中心，广西 南宁 530200

人体在正常生理代谢过程中会产生大量的自由基，如过氧化自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等，它们是人体疾病、衰老和死亡的直接参与者，一般情况下，当体内自由基的产生与清除能力处于平衡状态时，受控的自由基对人体是有益的，一旦失衡，体内就会出现“氧化应激”状态，这时则需要通过补充抗氧化剂来调整体内自由基平衡，以防止疾病的发生[1]。日常中，被广泛应用于化妆品、保健食品和药物中的抗氧化剂多为人工化学合成制品，存在有诸多毒副作用，难以满足人们的生活需求[2]。

内生真菌是指生活在健康植物组织器官内部，但不会引起宿主植物出现明显病害症状的一类真菌，包括一些在其生活史的某一阶段表面生的腐生菌、潜伏性病原菌和菌根菌[3]。人们对内生真菌的研究始于1993年，美国科学家Stierle首次从太平洋短叶红豆杉(Taxusbrevifolia)韧皮部中获得1株能够生产抗癌物质紫杉醇的内生真菌Taxomycesandreanae[4]。近年来的研究[5]显示，内生真菌能提高宿主植物对非生物胁迫与生物胁迫的抗逆性，部分内生真菌能自身产生与宿主植物相同或相近的活性成分物质。因此，从植物中分离和筛选出具有抗氧化活性的内生真菌，对食品、医药等工业具有重要意义。

青钱柳Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.系胡桃科青钱柳属植物，又名青钱李、山麻柳、山化树、一串钱、山麻柳、甜茶树等，为我国特有的单种属珍稀植物，有植物界大熊猫和医学界的“第三颗树”以及“天然胰岛素”的美誉，其树皮、叶具有清热消肿、止痛功效，可用于顽癣，集绿化、保健、药用、材用于一体[6]。研究[7]表明，青钱柳组织中含有黄酮类、酚类、萜类等多种化学成分，具有抗氧化、抗菌及抗肿瘤等活性作用。青钱柳不同溶剂提取物对DPPH、超氧、羟自由基均具有不同强度的清除能力[8]，青钱柳叶70 %乙醇提取物具有较好的抗氧化活性，一些成分的体外抗氧化活性强于VC[9]。但是，现阶段国内外有关青钱柳内生真菌的研究报道尚少。研究以青钱柳内生真菌为研究对象，筛选出活性较高的菌株并加以分类鉴定，旨在为寻找新型天然抗氧化剂提供可利用的候选菌株资源。

1 材料与方法

1.1 材料植物 材料于2019年4月采自广西百色市乐业县雅长乡(E 106°20′；N 24°84′)，由广西中医药大学谭小明研究员鉴定为青钱柳C.paliurus。131株内生真菌分别从青钱柳的根、茎皮等组织中分离获得。以上材料采保藏于广西中医药大学药学院。

1.2 方法

1.2.1 内生真菌发酵液制备 在无菌超净工作台上，采用PDA平板培养基活化真菌7 d，然后用接种针挑取3个菌块(直径为6 mm)，接种到含 100 mL PDA液体培养基锥形瓶(250 mL)中，在转速为 120 r/min 的摇床上震荡暗培养10 d(培养温度为 25 ℃)。发酵液用4层无菌的干净纱布过滤。将滤液于 10，000 r/min 条件下离心 10 min，取上清液于 45 ℃，8×103Pa 条件下旋转蒸发浓缩至浸膏状，称重，加无菌去离子水配成 10 mg/mL 的样品溶液，保存于 4 ℃ 冰箱备用。

1.2.2 DPPH自由基清除率测定 DPPH法快速、简便、重现性好，自由基DPPH·在有机溶剂(如甲醇、乙醇)中非常稳定，显紫色，在 517 nm 波长处有强吸收，DPPH溶液与自由基清除剂混合时，颜色由紫色变成浅黄色。参考文献的方法[12]，以Vc作阳性对照，检测青钱柳内生真菌发酵产物对DPPH·自由基清除能力。清除率的计算公式如：DPPH清除率(%)=[(A0-Ai)/A0]×100，式中：A0为空白对照OD值，Ai为样品或阳性对照DPPH溶液的OD值。

1.2.3 羟基(·OH-)自由基清除能力测定 OH是毒性最大的活性氧自由基，会引起脂质过氧化作用及造成人体损伤。利用Fenton反应体系法[12]，以Vc作阳性对照，在 510 nm 处检测青钱柳内生真菌发酵产物清除·OH-的能力，清除率的计算公式同1.2.2。

1.2.4 亚铁离子(Fe2+)螯合能力测定 铁具有高反应活性，能促使机体发生脂质氧化反应，对亚铁离子的螯合，可以减少氧化损伤。采用Ferrozine(菲啰嗪)比色法[12]，以EDTA-2Na作阳性对照，在 562 nm 处检测青钱柳内生真菌发酵产物对亚铁离子的螯合能力，对亚铁的螯合率计算公式如：Fe2+螯合能力清除率(%)=[(A0-Ai)/A0] × 100，式中：A0为空白对照的OD值，Ai为加有样品或阳性对照后的OD值。

通过1.2.1-1.2.4方法，综合筛选出18株活性较好的菌株，作为深入研究对象，进行以下2种抗氧化活性指标的实验。

1.3 统计分析 采用Excel 2019和DPS 7.05 对试验数据进行统计分析，最小显著差数法(LSD)进行单因素方差分析。不同小写字母表示差异性显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异性极显著(P<0.01)。

2 结果与分析

2.1 青钱柳内生真菌发酵产物对DPPH自由基清除作用 通过DPPH自由基清除试验发现，有35株真菌发酵液清除率高于50%(见表1)，占总供试菌株的25%。其中清除率低于60%高于50%的菌株有10株，编号894F和851F的清除能力最低，均为50.12%；清除率低于70%高于60%的菌株有17株，大于70 %共8株，清除率介于70%～80%之间的菌株有7株，编号分别为913J、885J、892J、909F、882F、937F、820F；清除率高于80%菌株仅1株，编号为937J，为81.32%，131株内生真菌清除DPPH能力均小于VC的清除率85.90%。

表1 青钱柳内生真菌DPPH自由基清除能力测定结果

2.2 青钱柳内生真菌发酵产物对·OH-自由基清除作用 共有103株真菌的·OH-清除能力大于50%，占总供试菌株的77%(见表2)。其中清除率在50%至60%的菌株有17株，编号为903J清除率最低，为50.00%；清除率介于60%～70%、70%～80%之间的菌株分别有25株、29株；清除率高于80%低于90%的菌株有32株，其中，共有7株清除率高于阳性对照VC清除率85.83%，编号为824F、894F、907F、885F、890F、912F、876F；菌株912F和876F的清除能力最强，清除率分别为 87.83%、87.74%。

表2 青钱柳内生真菌·OH-自由基清除能力测定结果

续表2

2.3 青钱柳内生真菌发酵产物对Fe2+螯合能力 共计88株内生真菌的Fe2+螯合能力高于50%，占总供试菌的67%(见表3)。清除率大于50%小于60%的菌株有38株，编号930F清除能力最低，为50.14%；清除率在60%至70%之间的菌株36株，清除率高于70%低于80%的菌株有12株，编号为911F、926F、851F、929F、808F、820F、810F、850F、845F、823F、912F、898F；清除率高于80%共有2株，编号为907F、840F，清除率均为82.24%，均低于阳性对照EDTA-2Na清除率85.07%。

表3 青钱柳内生真菌Fe2+螯合能力测定结果

3 讨论

内生真菌的生物活性取决于其代谢产物所含的功能性成分。文献研究表明，目前国内外对青钱柳内生真菌抗氧化和抗菌活性方面的研究报道较少，仅有寇晓琳等[12]对青钱柳内生真菌的抗菌活性进行研究，研究结果从67株内生真菌中筛选出7株菌株具有稳定产生黄酮类化合物的能力，进一步的抗菌实验发现其中具有较强的抑菌活性作用。相近属种的其他植物如野核桃[13]和核桃[14]则开展了内生真菌的抗菌和抗氧活性的研究。可见，胡桃科植物内生真菌蕴藏有抗菌、抗氧化等多种代谢活性物质，这同植物与宿主的“共生理论”达成一致，也说明胡桃科植物内生真菌是寻找高抗氧化活性物质的可选资源。