民族药黑骨头药材杠柳毒苷含量测定的方法研究

杨勇帮 李健田 白 玥

1.云南省玉溪市食品药品检验所，云南 玉溪 653100；2.普洱学院，云南 普洱 665000

民族民间用药是中华传统医药的重要组成部分，其历史悠久并具很强的地域性。黑骨头为云南省哈尼族、彝族常用药材[1]，别名有铁骨头、牛尾蕨、青蛇胆、黑龙骨、青风藤等。主要用于腰痛、风湿麻木、跌打损伤及蛇咬伤的治疗。黑骨头最早是《云南省药品标准》(1974)[2]収载品种，现为《云南省中药材标准》(2005年版)[3]収载品种；其植物来源为萝藦科植物黑龙骨PeriplocaforrestiiSchltr.及青蛇藤Periplocacalophylla(Wight) Falc.的干燥老茎和根。《云南省中药材标准》(2005年版)黑骨头药材标准项下初步制订了名称、来源、性状、薄层鉴别、检查(水分、总灰分)、浸出物等项目，但没有对其指标成分进行定性和含量测定；难以控制药材的质量，无法保证临床用药的安全性和有效性。因此完善和提高黑骨头药材质量标准显得非常有必要。

现代对黑骨头药材的研究，更多的是对植物黑龙骨的成分研究[4-6]；而对植物青蛇藤的研究非常少见，仅见《青蛇藤化学成分研究》《青蛇藤正丁醇部分苷类成分的分离与鉴定》等文献。现有的文献报道，黑骨头的研究多集中在化学成分、总皂苷、总黄酮及槲皮素-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷的含量测定和药理作用等方面，未见关于黑骨头和杠柳毒苷定性鉴别及含量测定方法的研究报道[7]。对于黑骨头药材质量标准研究，特别是采用HPLC方法测定青蛇藤中杠柳毒苷的含量研究，目前尚无相关研究的文献报道。因此，本实验确定以强心苷类具有促进伤口愈合作用的杠柳毒苷作为控制指标，对黑骨头药材中杠柳毒苷成分的含量进行测定，并对其方法进行验证，以便能更全面地分析评价其药材质量和安全性。为民族药黑骨头的质量标准控制提供参考，同时也为黑骨头药材及相关制剂进一步研究和开发提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ME403E 103型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、CPX5800H-C型超声清洗仪(必能信超声(上海)有限公司)、BP211D型电子天平(赛多利斯)、DHG-9140A型鼓风干燥箱(上海合恒仪器有限公司)、1260 Infinity型高效液相色谱仪(安捷伦科技)、粉碎机(瑞安市永历制药机械有限公司)、MS204型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)、Cavy 60 UV-Vis型紫外可见分光光度计(安捷伦科技)、DESA6A薄层色谱板成像仪。

1.2 材料 杠柳毒苷对照品(纯度：98%，CAS No.13137-64-9，成都普瑞法科技开发有限公司)纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，三氯甲烷、丙酮、甲醇、无水乙醇、95%乙醇均为四川西陇科学有限公司，30%乙醇、45%乙醇、70%乙醇(现配现用，均用无水乙醇和纯净水配制)，乙腈(色谱纯，四川西陇科学有限公司)，所用试剂除乙腈外均为分析纯，并且均在有效期内。

云南地产药材黑骨头，经玉溪市食品药品检验所副主任中药师牟娟鉴定为萝藦科植物青蛇藤Periplocacalophylla(Wight) Falc.的干燥茎切片。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 溶液的制备 供试品制备：将黑骨头样品粉碎成粗粉，过2号筛，取药材粉末约2 g，加入甲醇25 mL，超声提取30 min，将滤液过滤后放在恒温水浴锅上蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。对照品溶液制备：取杠柳毒苷对照品适量，加入甲醇溶解制成1 mg/mL溶液，作为对照品试液。

样品 对照品

样品 对照品

2.1.2 薄层色谱 鉴别照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部[8])试验，分别吸取供试品溶液10 μL，杠柳毒苷对照品溶液20 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，将薄层板置于展开缸中预饱和15 min，以三氯甲烷：丙酮：水(10∶3∶1)为展开剂上行展开，展开，取出，挥干溶剂，喷以5%硫酸乙醇溶液并在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别又置于紫外光灯(365 nm)下视检。供试品色谱中在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的斑点和荧光斑点。可以初步确定黑骨头药材中含有杠柳毒苷。结果见图1、图2。

2.2 杠柳毒苷含量的测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B，按表1所示流动相洗脱程序；柱温25 ℃：检测波长220 nm，流速 1 mL/min。对照品及供试品色谱图如图3、图4所示。

表1 流动相洗脱程序

图3 对照品图谱

图4 样品图谱

2.2.2 对照品溶液的制备 取杠柳毒苷对照品适量，精密称定，加45%乙醇溶液制成每1 mL含0.207 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密称取黑骨头粉末约2 g，置于锥形瓶中，精密量取45%乙醇25 mL加入至锥形瓶，称定重量。置于超声提取30 min，再次称重，补足减失的重量后过滤，取续滤液作供试品溶液备用。

2.2.4 检测波长的确定 将制备好的对照品溶液取适量置于比色皿中，放入Cavy 60 UV-Vis型紫外可见分光光度计中进行全波长扫描，最终确定杠柳毒苷最大吸收波长为220 nm。

2.2.5 线性关系的考察 称取杠柳毒苷对照品10.57 mg至50 mL容量瓶中，加入45%乙醇溶液至刻度，即得到浓度为0.207 mg/mL的对照品储备溶液。取杠柳毒苷对照品储备溶液25 mL至 100 mL 量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到浓度为0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液。取1 mL浓度为 0.052 mg/mL 杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到0.0052 mg/mL杠柳毒苷溶液；取2 mL浓度为0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到 0.0104 mg/mL 杠柳毒苷溶液；取5 mL浓度为0.052 mg/mL杠柳毒苷溶液至10 mL量瓶45%乙醇溶液至刻度，得到0.026 mg/mL杠柳毒苷溶液；取5 mL浓度为0.207 mg/mL杠柳毒苷溶液至 10 mL 量瓶加45%乙醇溶液至刻度，得到 0.104 mg/mL 杠柳毒苷溶液；再取0.052、0.207 mg/mL 的对照品溶液，共计6个不同浓度的对照品溶液，按色谱条件：ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱；以水为流动相A，乙腈为流动相B按表1所示流动相洗脱程序；柱温25 ℃：检测波长220 nm，进行高效液相色谱分析，以进样浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程Y=6225X+0.2665,R2=0.9999，在0.005 mg/mL～0.207 mg/mL浓度范围内，线性关系良好。

2.2.6 精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液按“2.2.1”色谱条件连续进样6次，记录峰面积，结果杠柳毒苷峰面积RSD值为0.4%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 重复性试验 按供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中进行测定峰面积，计算含量得平均含量为0.5717 mg/g，RSD值为1.4%，表明方法重复性良好。

2.2.8 稳定性试验 取供试品溶液，分别在室温0 h、4 h、6 h、8 h、12 h、18 h、24 h的时间下按“2.2.1”色谱条件进行测定峰面积，RSD值为0.59%。表明供试品在24 h内稳定。

2.2.9 加样回收率试验 精密称定已知含量(0.5717 mg/g)的供试品6份至不同的锥形瓶中，精密加入杠柳毒苷对照品溶液(0.207 mg/mL)3 mL ，照供试品溶液的制备方法制备。取上述6份供试品溶液分别进样10 μL，测定其峰面积并计算含量。根据(《中国药典》2015版四部)分析方法验证指导原则准确度计算方法(用实测值与供试品中含有量之差，除以加入对照品量)，即计算加样回收率=(实测含量-所取样品含量)/加入对照品量×100%)及RSD值。结果：平均回收率为99.1%，RSD为0.94%，表明该HPLC检测条件、方法的可靠性强。如表2所示。

表2 加样回收实验

2.2.10 样品测定 取3批样品，分别取2 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，进样。按色谱条件进行测定峰面积，计算含量结果见表3所示。

表3 样品测定结果

3 结论与讨论

通过按本试验方法条件进样考察，表明线性关系良好、仪器精密度良好、方法重复性良好、供试品溶液在24 h内基本稳定，本方法所测的黑骨头药材样品中的杠柳毒苷含量为0.5717mg/g(0.057%)，根据(《中国药典》2015版四部)中对高效液相色谱法回收率的要求，其在85%～90%至108～110%之间均符合标准规定。本次加样回收试验杠柳毒苷的回收率为99.1%，在标准规定允许范围内。表明该方法准确、可靠，对今后黑骨头药材的质量控制和科学评价提供了参考依据。通过前期的实验考察，采用不同的柱温分别观察色谱柱的分离能力，最终确定柱温25℃分离度最好。以水为流动相A，乙腈为流动相B，不同梯度洗脱程序进行验证，最终确定洗脱程序。经过多次实验，最终确定使用C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)分离效果好、达到实验要求。

通过对黑骨头药材的初步研究，发现云南习用的黑骨头药材来源大多是萝藦科植物青蛇藤的干燥老茎。通过查阅相关文献及采用薄层色谱鉴别方法，并与杠柳毒苷对照物质的比较，初步确定了药材青蛇藤中含有杠柳毒苷，为后续采用高效液相色谱法测定杠柳毒苷含量奠定了物质基础，同时为完善及提高黑骨头药材标准打下坚实的基础。