三种杀虫剂对昆虫病原线虫侵染臭椿沟眶象幼虫能力的影响
2021-10-20郑惠中杨开朗覃艳妮郭文娟温俊宝
郑惠中，杨开朗，覃艳妮，郭文娟，温俊宝
(北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室，北京 100083)
臭椿沟眶象Eucryptorrhynchusbrandti(Harold)属鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae沟眶象属Eucryptorrhynchus，是危害臭椿Ailanthusaltissima(Mill.)Swingle及其变种千头椿的主要钻蛀性害虫(赵养昌, 1980; Borovec, 2013)，常与其近缘种沟眶象E.scrobiculatus(Motschulsky)混合危害，近年来在宁夏发生尤其严重，已成为危害宁夏林业的主要害虫。臭椿沟眶象幼虫孵化后蛀入韧皮部，随着虫体发育向内钻蛀取食，形成不规则坑道，严重破坏臭椿树的输导组织(葛腾, 2000)。臭椿受臭椿沟眶象和沟眶象的单独或混合危害，造成大量死亡或树势衰弱。
近年来生产上利用昆虫捕获网对沟眶象的阻隔及捕获效果显著(Yangetal., 2018; Yangetal., 2019)，但因沟眶象和臭椿沟眶象的体型区别，臭椿沟眶象虫体小肩部窄，行动更灵便，易穿过裙摆式捕虫网的洞口，因此无法用捕虫网有效防控臭椿沟眶象。目前对臭椿沟眶象等钻蛀性害虫仍以化学防治为主。王旭(2019)对臭椿沟眶象幼虫的杀虫剂室内毒力测定结果显示氯氰菊酯>吡虫啉>啶虫脒；杨鹏(2015)通过树干注药测试杀虫剂对沟眶象的防治效果，其中5%吡虫啉对沟眶象的致死率为38.79%，为效果较优的药剂；杨开朗(2015)在两种象甲危害初期，在树干捆绑塑料裙基础上使用氯氰菊酯常规喷雾，在危害初期防治效果较好。由于臭椿沟眶象幼虫在树干内隐蔽活动、越冬，林间注药、喷雾得使用高药量、频用药才可以起到防治效果，对环境危害大、农田土壤污染重，且害虫易产生抗药性。为降低农药使用量，本研究寻找新的针对臭椿沟眶象幼虫高效、环境友好的防治技术(杨忠岐等, 2018)。
昆虫病原线虫(Entomopathogenic nematodes, EPN)能主动搜寻寄主昆虫、专性寄生，适应臭椿沟眶象幼虫的钻蛀特性。EPN对人畜、植物及有益生物安全，在大多数欧美国家和政府可以豁免注册、生产及施放(丛斌等, 1999; 董国伟等, 2001)。全球已有多种昆虫病原线虫商品化生产并田间大面积应用。我国有使用斯氏线虫防治臭椿沟眶象、沟眶象的初步探索(佟振亮等, 1993; 秦绪兵等, 1999)，对象甲类害虫进行生物防治时常选用斯氏线虫。如SteinernemacarpocapsaeA24对香蕉扁黑象甲幼虫和成虫都有较高的毒力(徐洁莲, 1991)；Dembilio等(2009)利用斯氏线虫S.carpocapsae在田间控制红棕象甲Rhynchophorusferrugineus的防治效果为83.8%～99.7%；Shamseldean等(2004)分别从3个不同的区域收集了3种有效的Steinernema线虫，经过室内实验对红棕象甲的致死率均能达到100%；Llácer等(2009)使用手动背负式喷雾器对棕榈树干和基部进行喷洒，对红棕象甲的防治效果可达到80%和98%。因此本试验选用了对臭椿沟眶象幼虫防效较好的两个商品化斯氏线虫品系。
将昆虫病原线虫与其他杀虫制剂结合使用，是对许多害虫常规化学防治的有效替代。与普通化学杀虫剂相比，EPN的使用成本仍然过高，将EPN与杀虫剂联合使用，可有效抑制害虫危害(Koppenhofer and Grewal, 2005)，减缓抗药性的发展，也可以降低EPN的施用量从而降低防治成本(Yanetal., 2012)。EPN和苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis、白僵菌Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin、吡虫啉等混用比各自单独使用会产生协同作用(Koppenhöferetal., 1997; Koppenhöferetal., 1998; Koppenhöferetal., 2000; Polararevpnetal., 2007; Koppenhöferetal., 2008)。王果红等(2007)利用小卷蛾斯氏线虫All品系与毒死蜱、吡虫啉混用防治褐纹甘蔗象Rhabdosceluslineaticollis(Heller)，防效明显优于单独使用化学药剂毒死蜱、吡虫啉或小卷蛾斯氏线虫。王玉东等(2012)将低浓度的吡虫啉与S.longicaudumX-7线虫混用后处理暗黑金龟Holotrichiaparallela2龄幼虫，杀虫效果明显提高。Williams等(2013)将S.carpocapsaeWeiser线虫、白僵菌、绿僵菌配置悬浮液混合在树桩周围施用，防治蛀干害虫松树皮象Hylobiusabietis，对松树皮象的致死率可达60%等。
本文测定了3种化学杀虫剂与不同品系商品化斯氏线虫混合使用的效果，通过确定高效应用组合，为臭椿沟眶象幼虫的综合治理和未来昆虫病原线虫的田间应用提供参考。
1 材料和方法
1.1 供试昆虫及线虫
供试昆虫：臭椿沟眶象3龄幼虫，采自宁夏石嘴山市平罗县小兴墩、大兴墩、通伏乡等地，由室内人工饲料配比喂养(具体方法见表1)。
表1 臭椿沟眶象幼虫人工饲料配置比例
供试线虫：采用市面上现有的商品化线虫，小卷蛾斯氏线虫S.carpocapsaeAll、长尾斯氏线虫S.longicaudumX-7，均购自浙江绿神天敌生物技术有限公司。实验用不同批次的线虫重复两次。
1.2 供试化学药剂
供试化学药剂商品信息见表2。在王旭(2019)研究基础上，将上述3种杀虫剂对臭椿沟眶象幼虫的LC50设为基础浓度，在此基础浓度上再分别用蒸馏水稀释5倍、10倍、20倍(简称为1/5 LC50、1/10 LC50、1/20 LC50)；即吡虫啉为153.3、30.66、15.33和7.67 μg/mL，氯氰菊酯为88.97、17.79、8.89和4.45 μg/mL，啶虫脒为307.89、61.58、30.79、15.39 μg/mL。
表2 杀虫剂及来源
1.3 药剂对线虫存活和侵染率的影响
用蒸馏水将供试线虫稀释为100 IJs/mL摇匀，将各药剂稀释成所需浓度梯度LC50、1/5 LC50、1/10 LC50和1/20 LC50。取5 mL上述混匀液体移入培养皿(直径9 cm)在25℃±1℃的黑暗条件下放置24 h，显微镜下每个处理随机检查1 mL混合液中线虫的存活数量，计算存活率。每处理设3个重复，以清水线虫悬浮液作对照。若药剂对线虫的致死作用或者亚致死作用没有超过10%，则继续测定该药剂对线虫侵染率的影响。
参照魏洪义等(1991)判定昆虫病原线虫对药剂的反应标准：(1)死亡：身体僵直或卷曲，不活动，对针刺无反应；(2)亚致死：身体卷曲，由于药剂麻痹作用引起痉挛性或抽搐性活动，对针刺无反应或反应非常迟缓；(3)不受药剂影响：与对照线虫一样，身体活动舒展或静止不动，不动的线虫经探针触碰后反应迅速。
1.4 线虫与药剂混用对臭椿沟眶象幼虫的作用效果
将单头臭椿沟眶象3龄幼虫放入装有30 g人工配制饲料的饲养杯中(直径5 cm、高4.5 cm)。设药剂单独处理、线虫(200 IJs/虫)单独处理、线虫(200 IJs/虫)与药剂混合处理和清水对照。将参试药剂配成所需浓度备用，将线虫悬浮液加入参试药剂，按设定浓度配成系列试剂，摇匀，取1 mL均匀喷施药剂、线虫及两者混合液，使药剂或线虫渗入饲料中，以便触及试验对象，将盖子轻盖，置于25℃±1℃下培养。每个处理10头幼虫，3次重复。处理72 h，每24 h检查幼虫存活情况。
1.5 数据分析
数据处理及统计分析全部在EXCEL、SPSS软件中进行，处理间经方差分析差异显著后，用Duncan多重比较方法进行显著性分析。昆虫病原线虫对臭椿沟眶象幼虫的致病力均用死亡率(%)和校正死亡率(%)表示：
由χ2独立性检验判断线虫与化学药剂对臭椿沟眶象幼虫的联合作用类型(张中润等, 2006; 王玉东等, 2012)。
M=[MN+MI(1-MN)]
ME=M×N
χ2=(MNI-ME)2/ME
其中，M、ME分别表示线虫与各药剂混用对供试昆虫的期望致死率及致死数；MN和MI分别为线虫和各药剂单独处理供试昆虫的校正死亡率；MNI为线虫与各药剂混用对供试昆虫的实际校正死亡率；N为供试昆虫总数。
线虫与各药剂混用后联合作用类型的判断依据为：当χ2< 3.84(df=1和P=0.05)时，显示两种杀虫因子混用表现为相加作用(Additivity)，即两种杀虫因子混用后的毒力和各因子毒力的总和相似；当χ2≥ 3.84(df=1和P=0.05)及MNI
2 结果与分析
2.1 杀虫剂对昆虫病原线虫存活的影响
分别用吡虫啉、啶虫脒和高效氯氰菊酯药液连续浸泡2个品系供试线虫，24 h检查发现，在试验浓度内3种杀虫剂对供试线虫均无亚致死作用，只有不同程度的死亡现象，但死亡率均未超过10%，且死亡率并随各药剂浓度降低而降低。与对照相比，啶虫脒对线虫致死率最高，为4.2%，氯氰菊酯次之，吡虫啉最安全。2个品系线虫对不同药剂的耐药性存在差异(P<0.05)，X-7品系对氯氰菊酯的耐药性更强一些。3种药剂低浓度处理线虫死亡率差异不大，但啶虫脒引起的死亡率较其它稍高。
表3 不同浓度的化学杀虫剂对线虫死亡率的影响
2.2 线虫与药剂对臭椿沟眶象幼虫的交互作用
2.2.1不同浓度的氯氰菊酯与2个品系线虫混用对臭椿沟眶象幼虫的致死效果
参试药剂氯氰菊酯单独处理臭椿沟眶象幼虫表现出较低的致死效果，只有在LC50(88.97 μg/mL)表现出30%左右的致死作用。参试线虫分别与氯氰菊酯LC50(88.97 μg/mL)混用的致死效果显著高于低剂量混用效果。氯氰菊酯各浓度与线虫混用的杀虫效果(DNI)比氯氰菊酯单用(DI)、线虫单用(DN)均明显提高。其中X-7与1/10 LC50(8.89 μg/mL)混用对臭椿沟眶象幼虫的致死效果为增效作用，比氯氰菊酯单用直接增加了33.34%的死亡率，比线虫单用直接增加35%的死亡率，而其它剂量与线虫混用的致死效果则为相加作用(表4)。
表4 2个品系线虫与氯氰菊酯混用对臭椿沟眶象幼虫的交互作用
2.2.2不同浓度的吡虫啉与2个品系线虫混用对臭椿沟眶象幼虫的致死效果
结果显示吡虫啉单独处理臭椿沟眶象幼虫，幼虫的死亡率与药剂浓度成正相关。低浓度混用致死效果要好于高浓度混用的效果。吡虫啉和X-7、All混用比单用的致死效果高，死亡率均在50%以上，表现出相加或增效作用；其中1/20 LC50(7.67 μg/mL)与X-7混用表现出增效作用，作用效果为54.17%，效果增加224.96%，高于与All混用的防效(表5)。
表5 2个品系线虫与吡虫啉混用对臭椿沟眶象幼虫的交互作用
2.2.3不同浓度的啶虫脒与2个品系线虫混用对臭椿沟眶象幼虫的致死效果
啶虫脒单独处理臭椿沟眶象幼虫，幼虫的死亡率与药剂浓度成正相关。啶虫脒的不同浓度梯度与2种线虫X-7、All混用时，比相同浓度药剂单用或线虫单用的致死效果提高，均表现为相加作用。其中X-7与啶虫脒LC50(307.89 μg/mL)混用比药剂单用对臭椿沟眶象幼虫的致死率增加32.36%(表6)。
表6 2个品系线虫与啶虫脒混用对臭椿沟眶象幼虫的交互作用
3 结论与讨论
将昆虫病原线虫与化学杀虫剂混用，既可以提高臭椿沟眶象幼虫的防治效果，又可以降低化学药剂的污染及延缓害虫抗药性的产生，是臭椿沟眶象幼虫综合治理的有效手段。昆虫病原线虫可以与许多农药兼容并混合使用，但也有多种农药对线虫的生存会有影响，任何新的线虫种-农药组合都需要评估相容性(Koppenhöfer and Grewal, 2005)。因此线虫与杀虫剂混用并非简单地将两者混配，而必须通过对线虫安全性和适合度的相关试验来验证。昆虫病原线虫对不同化学药剂的耐受能力不同，选择对线虫安全的化学药剂也是混用成功的关键(王玉东等, 2012)。
本研究发现测试的3种化学药剂对供试线虫均无亚致死作用。2种昆虫病原线虫对不同杀虫剂的耐药性存在差异，其中吡虫啉造成的线虫致死率较低，是对线虫较为安全的混配农药，低浓度氯氰菊酯次之，而啶虫脒和高浓度氯氰菊酯对2种线虫的致死率与对照相比显著提高。Yan等(2012)将环境友好型杀虫剂与昆虫病原线虫结合使用，结果显示其中使用的氯氰菊酯和吡虫啉等对线虫的存活和传染性无不良影响，与本试验结果一致，证实吡虫啉、氯氰菊酯可与线虫混用。
Koppenhöfer(2005)和Grewal(2005)等研究说明两种因子对某一害虫的联合使用，可对害虫的杀灭速度和死亡率产生拮抗、叠加或增效作用。叠加效应表示两种药剂相互独立行动，没有相互作用；增效作用是指两种药剂的联合(或补充)作用，其效果比单独作用药剂的效果之和更大。在本试验中，2种线虫与3种供试药剂混用后对臭椿沟眶象3龄幼虫的防治效果存在明显差异，混用后的杀虫效果比两者单用的效果提高。其中线虫与化学药剂 LC50、1/5 LC50剂量混用后均表现叠加作用，1/20 LC50的吡虫啉、1/10 LC50的氯氰菊酯与S.longicaudumX-7品系混用可产生明显的增效作用。本研究结果表明，氯氰菊酯和吡虫啉可与昆虫病原线虫混用，共同防治臭椿沟眶象。
杀虫剂和昆虫病原线虫之间的增效效果，主要是两种机制：杀虫剂影响线虫的行为，或者杀虫剂影响目标害虫的行为，这种更常见(Koppenhöfer, 2005; Grewal, 2005)。Koppenhöfer 等(2000 b)研究发现，线虫与吡虫啉混用后，吡虫啉减少蛴螬的防御行为，从而增加线虫对蛴螬的附着和渗透，即通过药剂降低目标害虫对线虫的防御能力，从而利于线虫的侵染；另外药剂可能刺激线虫的感受神经，使线虫兴奋活性提高，导致线虫的搜索和攻击能力增强(Koppenhetal.1998; 武海斌等, 2014)。出于成本考虑本文主要对低剂量浓度进行了研究，并根据结果推测低剂量的化学杀虫剂可能更有助于昆虫病原线虫侵害臭椿沟眶象幼虫。Koppenhöfer(2000)、Triggiani(1976)等研究发现，低剂量药剂能引起目标昆虫代谢活动的变化，使其释放物如CO2、分泌物等增多，而线虫对这些物质敏感。而高浓度药剂因为对线虫的存活有明显影响，可能抑制了线虫的活力。本研究未设计试验进行协同作用出现原因及低剂量效果较好原因的具体验证，未来需进一步研究。
在2种供试线虫中，X-7品系与3种药剂混用对臭椿沟眶象幼虫致死效果提升要均高于All品系与药剂的混用效果，因此 X-7品系可作为优选品系，进一步研究其与药剂混用对林间臭椿沟眶象幼虫的防治效果。近年来关于EPN防控钻蛀性害虫应用技术的研究逐渐增多，陆永跃(2012)对应用昆虫病原线虫防治香蕉假颈象甲的施用方法进行研究发现，将线虫液注入蛀道的注射法最优。目前国内林地野外应用昆虫病原线虫的技术还不成熟，仍处初步探索阶段。臭椿沟眶象幼虫钻蛀危害，隐蔽生活，如何采用合适的施用方法让线虫制剂接触到虫体是林间应用的难点。此外，面对宁夏干燥、紫外线强等环境特点，避免或改善对线虫不利的环境因子也是未来要重点考虑的方面。纳米技术、渗透处理等新方法或许可以为昆虫病原线虫抵抗恶劣环境提供新途径，同时针对臭椿沟眶象幼虫线虫和杀虫剂组合使用的经济可行性还需进一步研究。
