水稻OsLecRK1基因介导的抗褐飞虱功能分析

宋旭明，王谆静，麦迪乃·萨比尔，廖志洪，邓建宇，朱旭东，周国鑫*

(1.浙江农林大学现代农学院，杭州 311300；2.中国水稻研究所，杭州 310006)

水稻是亚洲地区的主要粮食作物，我国半数以上人口以稻米为主食。自20世纪70年代以来，我国开始大面积推广矮秆、多分蘖和具有耐肥特征的水稻品种，由于化学农药的不合理使用，导致近几十年来褐飞虱NilaparvatalugensStål频频爆发，严重威胁我国粮食安全(陈建明等，2003; 娄永根和程家安，2011)。抗虫水稻品种培育是褐飞虱综合治理最有效且经济的措施之一，各国科研工作者一直致力于水稻抗褐飞虱基因的发掘和利用(刘裕强，2009)。目前，已从抗性栽培稻和野生稻等资源中鉴定和定位了至少35个抗褐飞虱基因或QTL(Quantitative trait loci)，包括Bph1、bph2、Bph3、Bph9、Bph14等(Horganetal., 2015; Duetal., 2020)。

水稻抗褐飞虱基因Bph3，具有广谱的褐飞虱抗性和持久性，已广泛用于抗褐飞虱水稻品种的培育(Duetal., 2020)。Bph3基因簇包含4个凝集素类受体蛋白激酶(Lectin receptor-like kinases, LecRK)基因(OsLecRK1-4)，其中OsLecRK1-3对水稻褐飞虱的抗性具有累加作用，据估算单由OsLecRK1贡献的抗性占一半左右(吴寒，2013; Liuetal., 2015)。凝集素类受体激酶属于蛋白激酶的一个亚家族，一般由细胞外凝集素结构域、跨膜结构域和胞内激酶结构域组成(Heetal., 2017)。LecRK在应对生物胁迫和非生物胁迫中都发挥着重要作用，参与了植物对真菌、细菌和植食性昆虫为害的生物胁迫防御反应(Zhangetal., 2017)。通过胞外结构域识别信号分子，通过磷酸化、去磷酸化等方式转导防御信号，调控下游靶蛋白，影响植物免疫诱导反应(朱巍巍等，2018)。Liu等(2015)将OsLecRK1-3基因簇导入褐飞虱易感水稻品种中，显著增强了水稻对褐飞虱的抗性，同时增加了水稻对白背飞虱Sogatellafurcifera(Horváth)的抗性。另有报道水稻中过量表达G型LecRK基因，增加水稻对褐飞虱驱避性(吴艳, 2017)。水稻Pi-d2是一种B型LecRK基因，参与了对稻瘟病菌的抗性反应(Chenetal., 2006)。拟南芥Arabidopsisthaliana的LecRK-IX.1和LecRK-IX.2基因突变降低植物对疫霉菌的抵抗能力，且双突变会加剧感病表型；相反过表达LecRK-IX.1和LecRK-IX.2基因能增强植物的抗病性，诱导自发性细胞程序性死亡(Wangetal., 2015)。在野生烟草Nicotianaattenuata中，LecRK1基因在烟草对烟草天蛾Manducasexta诱导防御反应中起重要作用，LecRK1突变体烟草相对于野生型烟草，昆虫诱导积累的胰蛋白酶抑制剂和苏氨酸脱氨酶在突变体植株中的含量明显减少(Gilardonietal., 2011)。可见，LecRK家族基因在植物诱导免疫反应中起重要作用。

本文比较了水稻RHTd(含Bph3)、Mudgo(含Bph1)和ASD7(含bph2)等对褐飞虱的抗性，克隆及构建了OsLecRK1的过量表达突变体水稻，从反向遗传学角度明确了OsLecRK1可影响褐飞虱的多个生物学参数，该结果有望增加对水稻Bph3基因抗褐飞虱机制的了解，为水稻抗褐飞虱水稻培育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试水稻：抗褐飞虱水稻品种RHTd(含Bph3)、Mudgo(含Bph1)、ASD7(含bph2)，以及日本晴和TN1(Taichung Native 1)由中国水稻研究所提供。OsLecRK1基因过量表达水稻突变体株系TS17、TS19、TS21，由本实验室构建。种子于温控培养箱催芽后，在温室中用水稻培养液培养(温度27℃±2℃；相对湿度70%～80%；光照L∶D=16∶8)。

供试昆虫：褐飞虱(Rice brown planthopper, BPH)生物型I和II混合种群采集于浙江农林大学平山水稻田，以感虫品种TN1幼苗饲养于人工气候箱中(温度27℃±2℃;相对湿度70%～80%；光照L∶D=12∶12)，室内已至少繁殖10代以上。

试剂及仪器：RNA提取试剂盒MiniBEST Plant RNA Extraction Kit和反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(购自宝日医生物技术(北京)有限公司)；割胶回收试剂盒AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit(爱思进生物技术(杭州)有限公司)；克隆载体pEASY-Blunt Zero(北京全式金公司)；BIO-RAD PCR仪(美国BIO-RAD公司)；AL104电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；RXZ-380B智能型人工气候箱(宁波江南仪器厂)；Motic双目解剖镜(麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.2 方法

1.2.1OsLecRK1基因克隆

RHTd水稻叶片经液氮研磨后，取100 mg采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)试剂盒提取总RNA。总RNA经电泳及分光光度计检测后，由PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)将mRNA反转录成cDNA，具体实验步骤参照产品说明书。

根据NCBI的Rathu Heenati水稻OsLecRK1基因(KF748957)序列号，利用Primer Premier 5.0软件设计OsLecRK1基因特异性引物OsLecRK1-F: 5′-ATGGTTGCTCTGCTACTCTTC-3′和OsLecRK1-R: 5′-CTATGGAAGTGAGCTGATGAAG-3′。PCR反应在BIO-RAD PCR扩增仪中进行，反应程序如下：98℃预变性10 s，98℃变性10 s，60℃退火5 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共进行35次循环后，72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，利用AxyprepTM DNA Gel Extraction Kit(Axygen)试剂盒对PCR产物回收纯化。纯化的PCR产物连入pEASY-Blunt Zero载体，阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序鉴定。

1.2.2OsLecRK1过量表达突变体水稻构建

重组连接法将目的基因连接入植物表达载体p1301-35SN，获得重组质粒p13SN-OsLecRK1转入农杆菌EHA105。利用含p13SN-OsLecRK1的农杆菌工程菌通过本实验室建立的水稻遗传转化平台获得T0转基因植株，对T1、T2转基因植株进行潮霉素筛选和PCR鉴定，得到3个OsLecRK1基因过量表达突变体纯合株系TS17，TS19和TS21。农杆菌介导的水稻遗传转化和纯合转基因突变体筛选参照(周国鑫, 2009)。

1.2.3水稻千粒重和株高测定

随机选取饱满的野生型、OsLecRK1基因过量表达株系种子各100粒，在万分之一分析天平上称重，重复3次。随机选取野生型水稻和过量表达突变体水稻植株，测量水稻茎秆基部到最高叶片中间的高度，每处理重复10次。

1.2.4水稻对褐飞虱抗性评价

FPLI=100-(接虫植株的干重/未接虫植株的干重)×(1-危害级别/9)×100

1.2.5褐飞虱取食选择和产卵选择性测定

突变体水稻和野生型水稻各1株，用海绵将其固定于塑料杯中，使两株苗间距在1 cm左右。用一个圆筒形玻璃罩(直径4 cm，高8 cm)将两株水稻从茎秆基部一起套住，向玻璃罩内接入15头怀卵褐飞虱雌成虫，顶部用圆形海绵封住。在接虫1、2、4、8、12、24、48、72 h观察并记录两株苗上的虫数，72 h后去除所有褐飞虱，剪取试验水稻的茎秆，在双目解剖镜下镜检并统计两株苗上的产卵量，计算每株苗的卵量百分率，每个处理重复7次(王佳妮等, 2018)。

1.2.6褐飞虱分泌的蜜露量分析

单株种植的突变体水稻和野生型水稻。将石蜡薄膜(parafilm)小袋子(4 cm×3.5 cm)套于45 d苗龄的水稻基部1 cm以上位置，每个袋中放入1头经饥饿处理3 h的褐飞虱雌成虫，处理重复10次以上。实验前于万分之一天平称量石蜡薄膜袋的重量，24 h后吸出袋中褐飞虱，再次称量蜜露袋的重量，两次重量之差即为褐飞虱分泌的蜜露量。

1.2.7褐飞虱初孵若虫发育历期等测定

选取长势一致的突变体和野生型水稻，用海绵将其固定于塑料杯中。圆筒形玻璃罩(直径4 cm，高8 cm)套于水稻茎秆基部，向玻璃罩内接入15头褐飞虱初孵若虫，顶部用海绵封住。每天观察并统计植株上褐飞虱若虫数量直至羽化，每个处理重复9～10次。统计和分析各处理褐飞虱的若虫存活率、若虫发育历期、羽化率、初羽化成虫体重和成虫短翅率。

1.2.8褐飞虱单雌产卵量和孵化率实验

单株种植的突变体水稻和野生型水稻，圆筒形玻璃罩(直径4 cm，高8 cm)套于水稻茎秆基部，接入1雌1雄初羽化褐飞虱成虫，顶部用海绵封好。接虫6 d后移除褐飞虱，每天观察水稻植株并统计孵化的若虫数量后清除褐飞虱若虫，直至连续6 d无若虫孵出。将水稻茎秆在解剖镜下镜检，统计未孵化的卵量，并计算孵化率。每个处理重复15次。

1.3 数据分析

数据采用DPS数据处理软件进行统计分析。两个样本间的比较采用Student’st-test或采用卡方检验；多样本平均数之间的差异采用One-Way ANOVA分析，并用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 RHTd等水稻抗褐飞虱评价

抗性评级结果表明，RHTd对褐飞虱具有较强的抗性。在接虫第5天，TN1水稻90%植株出现死亡，受害评级为8.6；而ASD7水稻的第二、第三片叶片出现枯黄，受害指数为5.8；RHTd和Mudgo的受害指数仅分别为1.4和2.8，水稻部分叶片出现发黄(图1-A)。不同时间4种水稻的褐飞虱着虫数表明，RHTd对褐飞虱具有明显的驱避性，在1～48 h内，RHTd上的褐飞虱数量均显著少于其它3种水稻(图1-B)。褐飞虱干重与功能损失指数作图表明，分别有11.1%、22.2%和66.7%的RHTd水稻在耐害性、抗生性和兼抗(抗生性和耐害性)的象限中；88.9%的Mudgo水稻对褐飞虱具有耐害性，而1/3的ASD7水稻对褐飞虱不具有抗性(图1-C)。

图1 不同品种水稻对褐飞虱的抗性

2.2 OsLecRK1基因过量表达转基因水稻的获得

根据NCBI的Rathu Heenati水稻OsLecRK1基因序列，克隆得到水稻OsLecRK1基因的CDS片段大小为2 442 bp(图2-A)。OsLecRK1基因的植物表达载体p13SN-OsLecRK1的T-DNA框结构如图2-B。通过农杆菌介导的水稻遗传转化法得到T0代OsLecRK1过量表达突变体水稻，经PCR鉴定和潮霉素筛选，最终筛选到OsLecRK1过量表达T3代3个纯合株系TS17，TS19和TS21(图2-C)。

图2 OsLecRK1基因克隆和过量表达突变体构建

2.3 过量表达OsLecRK1基因对水稻千粒重和株高的影响

与对照水稻日本晴千粒重25.6 g相比，过量表达OsLecRK1突变体植株TS17、TS19的稻谷千粒重分别减少了7.4%和3.6%，均具有显著差异，而TS21稻谷的千粒重与对照无差异(图3-A)。过量表达OsLecRK1基因并不影响水稻的株高，3个过量表达突变体水稻的株高与野生型相比均无显著差异(图3-B)。

图3 过量表达OsLecRK1基因对水稻的稻谷千粒重(A)和株高(B)的影响

2.4 过量表达OsLecRK1水稻对褐飞虱取食和产卵选择性影响

从4 h开始褐飞虱在OsLecRK1基因过表达株系TS17虫量明显地少于对照，该趋势逐渐增大并维持至72 h(图4-A)；而TS19、TS21株系上虫量分别于8 h和12 h后开始显著地少于对照，不同时间点分别仅为各自对照虫量的59.1%～76.3%和56.5%～74.7%(图4-B、图4-C)。褐飞虱在突变体TS17和TS21上的产卵量仅为对照的62.2%和76.7%，均显著地减少(图4-D)。表明OsLecRK1过量表达导致褐飞虱更倾向于在野生型水稻日本晴上栖息和产卵。

图4 OsLecRK1基因对褐飞虱雌成虫取食(A-C)和产卵(D)影响

2.5 过量表达OsLecRK1水稻对褐飞虱若虫发育历期等的影响

过量表达OsLecRK1水稻突变体株系TS17、TS19、TS21上的褐飞虱若虫存活数量均显著低于野生型水稻上的褐飞虱数量(图5-A)，但各突变体株系间无差异。在TS17，TS19株系上饲养的褐飞虱雌若虫发育历期分别为12.5 d和12.7 d，均显著长于对照组的12.1 d；TS19上的雄若虫发育历期为12.3 d也显著地长于对照组的11.8 d(图5-B)。野生型水稻上初羽化雌成虫体重为1.66 mg，分别仅为突变体水稻株系TS17、TS19、TS21上的初羽化雌虫体重的97.0%、97.5%和95.2%，均具显著性差异；而不同水稻上的初孵雄成虫的体重无显著差异(图5-C)。过表达突变体水稻品系TS17、TS19、TS21上的褐飞虱羽化率为62%、60.7%和62.7%，均显著地低于野生型水稻上褐飞虱的羽化率72.2%(图5-D)。过量表达OsLecRK1对褐飞虱若虫的存活率、羽化率、若虫发育历期、初羽化雌成虫体重均有显著的影响。

图5 OsLecRK1基因对褐飞虱若虫存活率(A)、若虫发育历期(B)、初孵成虫体重(C)和羽化率(D)的影响

2.6 过量表达OsLecRK1水稻对褐飞虱单雌产卵量、翅型分化和蜜露量的影响

野生型水稻上褐飞虱单雌产卵量为98.9粒，分别为突变体株系TS17、TS19、TS21上的褐飞虱单雌产卵量的1.87倍、1.74倍和1.80倍，均存在显著差异(图6-A)。突变体水稻株系TS17、TS19、TS21上的卵孵化率分别为38.5%、34.6%和40.7%，均极显著低于野生型水稻上的卵孵化率67.3%(图6-B)。在褐飞虱翅型分化上，过量表达突变体水稻株系上的褐飞虱短翅率在86.4%～88.3%，显著低于野生型水稻上短翅率95.1%(图6-C)。过量表达突变体水稻株系TS17、TS19、TS21上的褐飞虱蜜露量分别为7.1 mg、11.4 mg和8.2 mg，都显著低于在野生型上褐飞虱分泌的蜜露量18.7 mg(图6-D)。表明过量表达OsLecRK1对褐飞虱繁殖、翅型分化和蜜露量均有显著影响。

图6 OsLecRK1基因过表达水稻对褐飞虱单雌产卵量(A)、卵孵化率(B)、短翅率(C)和蜜露量(D)的影响

3 结论与讨论

本文对水稻RHTd(含Bph3)、Mudgo(含Bph1)和ASD7(含bph2)等材料进行了褐飞虱抗性评价。结果表明，含Bph3基因水稻RHTd对褐飞虱的抗性明显地强于含Bph1基因水稻Mudgo和bph2基因水稻ASD7，RHTd水稻的褐飞虱受害指数仅为Mudgo和ASD7水稻的53.5%和24.1%。根据褐飞虱对水稻品种产生的危害情况，将褐飞虱划分为4种生物型：生物型1、生物型2、生物型3和生物型4(刘开雨等, 2011)。邓飞等(2011)研究表明Mudgo(含Bph1)能抵抗褐飞虱生物型1和生物型3，ASD7(含bph2)能抵抗褐飞虱生物型1和生物型2，Rathu Heenati(含Bph3)对褐飞虱生物型1、2、3、4都具有抗性。有研究者对东南亚地区种植的水稻品系对褐飞虱抗性进行了评价，发现含有Bph3基因的水稻Rathu Heenati对褐飞虱的抗性显著高于其它水稻(Finbarretal., 2015)。刘裕强(2009)对Rathu Heenati(含Bph3)水稻的脂氧合酶(Lipoxygenase, LOX)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanineammonialyase, PAL)和H2O2进行了测定分析，发现褐飞虱取食后LOX、PAL和H2O2表达量与对照相比均有显著提高。

此外,本实验克隆并构建了OsLecRK1过量表达突变体水稻，利用该突变体分析了OsLecRK1基因对褐飞虱若虫存活率、若虫发育历期等生物学参数的影响。结果表明，褐飞虱若虫在OsLecRK1基因过量表达的突变体水稻上的存活率显著地降低，若虫发育历期显著地延长，羽化率和初羽化雌成虫体重均显著地降低。并且，褐飞虱在突变体水稻上取食分泌的蜜露量、单雌产卵量和卵孵化率均显著地减少。本研究证实了在水稻中仅过量表达OsLecRK1基因即可显著地增加水稻对褐飞虱的抗性，该基因可对褐飞虱的若虫存活率和发育历期等一系列生物学参数产生不利影响，如OsLecRK1基因过量表达的水稻降低褐飞虱若虫存活率、延长若虫发育历期、降低羽化率和单雌产量等，这一结果与Liu等(2015)研究结果相类似。Liu等(2015)通过图位克隆法分离和鉴定了水稻抗褐飞虱Bph3基因簇由4个凝集素类受体蛋白激酶(OsLecRK1-4)基因组成，其中OsLecRK4为无效基因；OsLecRK1基因对Bph3的抗褐飞虱作用贡献最大，在Rathu Heenati水稻背景下构建的OsLecRK1单基因缺失和OsLecRK1、OsLecRK2双基因缺失的突变体水稻对褐飞虱抗性分别下降了50%和75%。有文献报道在拟南芥中，凝集素类受体蛋白激酶LecRK-V.5基因突变，导致病原物相关分子模式触发的免疫反应(Pattern-triggered immunity, PTI)其相关抗性基因的表达量降低，胼胝质的形成受阻等(Singhetal., 2012)。OsLecRK1基因过量表达水稻对褐飞虱具有强烈的驱避性，可能是由于突变体水稻产生了对褐飞虱具有驱避作用的挥发性物质，也不排除突变体水稻产生了对褐飞虱的抗生性化合物如在水稻汁液中积累抑食剂或茎秆积累过量的胼胝质，具体机制还需进一步研究。以上的研究结果丰富了对OsLecRK1基因介导水稻抗褐飞虱的认识，加深了对Bph3基因抗褐飞虱机制的了解，也为水稻抗飞虱育种中Bph3抗源的科学利用提供了理论依据。