高温胁迫对筛豆龟蝽成虫抗氧化能力的影响

崔 娟，乔 方，胡英露，田鑫月，赵丽娜，史树森*

(1.吉林农业科技学院农学院，吉林 132101；2.吉林农业大学植物保护学院，长春 130118)

筛豆龟蝽Megacoptacribraria(Fabricius)属半翅目Hemiptera龟蝽科Plataspidae，是大豆等豆科作物的一种重要刺吸类害虫(Shietal., 2014)。目前，已知该害虫分布于我国及澳大利亚、美国、印度、印度尼西亚、日本、韩国、马来西亚、缅甸等国家，并有进一步扩展蔓延的趋势(Egeretal., 2010)，已成为世界性害虫。筛豆龟蝽喜温暖和湿润的环境(Liangetal., 2018)，25℃条件下，成虫寿命75 d，产卵前期35 d，单雌产卵量160粒，世代重叠严重，是我国南方各大豆产区的重要害虫(Shietal., 2014)，主要以成虫、若虫刺吸大豆茎秆，豆荚和叶片，为害严重时，田间被害株率达到70%～80%(Rubersonetal., 2013)，不防治的田块可造成大豆减产60%(Seiteretal., 2013)。

近年来，全球气候变暖导致我国南方区域性极端温度频发(马罡和马春森, 2016)，夏季最高气温往往超过40℃，尤其是中午到午后的3～4个小时(Zhangetal., 2015)。由于农田的开放式结构，夏季大豆田冠层温度较高，白天田间微生境较周围环境高0.9℃～4.5℃(Grant and Lamp, 2018)。如此高温环境对筛豆龟蝽种群的生存和发展影响如何？在全球气候变暖的大背景下，筛豆龟蝽对高温环境的适应性又如何？目前尚不十分清楚，而深入了解这些问题对明确其潜在分布区的预警和综合管理具有重要意义。

本研究测定了筛豆龟蝽在梯度高温胁迫下的存活情况及其体内SOD、CAT、POD、T-AOC的活性变化及MDA的含量变化，以期了解筛豆龟蝽成虫对极端高温环境的适应能力，进而明确其田间种群对极端高温环境的适应性，为研究该害虫的生态适应性评价及对其全球区域性分布扩张趋势分析提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试昆虫

筛豆龟蝽采自南京农业大学江浦试验基地大豆田(32°26′25″N, 118°50′23.47″E)，室内饲养。养虫室环境温度25℃±1℃，相对湿度65%～75%，光周期16 L∶8 D。成虫饲养在养虫笼(0.6 m×0.6 m×0.6 m)内，每笼50头，以结荚初期的盆栽大豆植株进行饲养，每笼2盆，每盆5株大豆，待成虫产卵孵化后，采集大豆叶片上同期初孵若虫，用小毛笔轻轻将其挑到开花期的大豆植株上饲养，每笼100头，15 d更换一次盆栽大豆，待若虫羽化，每50头同期羽化成虫放入新的养虫笼内饲养10 d备用。

1.1.2仪器材料

主要试剂：SOD、POD、CAT、T-AOC、MDA和总蛋白含量试剂盒均购于南京建成生物工程公司。

主要仪器：BIR-80DI生化培养箱(上海三滕仪器有限公司)；SP-756P紫外可见分光光度计(上海光谱有限公司)；Centrifuge 5430R多功能离心机(Eppendorf中国有限公司)；AL-204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2 方法

1.2.1试虫处理

根据中国中南部(筛豆龟蝽分布区)夏季最高气温可达到44℃，通常持续3个小时(Chenetal., 2014)，本试验选择37℃、40℃、43℃、46℃为高温梯度胁迫温度，处理时间4 h，以适温25℃(Shietal., 2014)为对照处理。取10日龄雌雄成虫置于干净无菌的小型有机玻璃养虫罐(10 cm×15 cm)内，每罐雌雄虫各10头，养虫罐底部放置等体积湿润的海棉保持罐内湿度(模拟田间小气候)，将上述养虫罐分别置于生化培养箱内进行相应温度处理。

1.2.2高温胁迫对筛豆龟蝽存活的影响

观察上述各温度处理后试虫的存活情况，用小毛笔轻轻碰触虫体，可以自由爬动，则视为存活，记录各处理成虫存活数量。

1.2.3抗氧化酶活性、总抗氧化能力和MDA含量测定

每个温度随机抽取处理后的雌雄成虫各5头为测定样本，3次重复。

酶液提取：准确称量各处理活虫质量，按照质量与0.86%生理盐水1∶9(m/v)的比例配置装入离心管，将离心管放置冰水混合物内，用微量研磨仪机械研磨成10%组织匀浆，将匀浆液在高速冷冻离心机4℃下冷冻离心15 min(12 000 r/min)，所得上清液为酶提取液。

蛋白质含量测定：参考Bradford(1976)方法，对蛋白质进行提取和测定。以牛血清蛋白为标准品制作蛋白质标准曲线。根据标准曲线计算出各样品总蛋白含量。

SOD、CAT、POD、T-AOC活性和MDA含量的测定，均参照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。

1.2.4数据统计与分析

使用单因素方差分析(ANOVA)分析不同处理温度下筛豆龟蝽成虫存活率及抗氧化酶活性的差异显著性(P<0.05)，并采用LSD测验进行多重比较。采用SPSS 18.0统计软件对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对筛豆龟蝽成虫存活的影响

筛豆龟蝽对高温适应性比较强，在37℃、40℃、43℃和46℃下处理4 h后，成虫存活率均为100%，与对照无显著差异。

2.2 筛豆龟蝽成虫体内抗氧化酶活性对高温胁迫的响应

2.2.1筛豆龟蝽成虫SOD活性对高温胁迫的响应

各高温处理对SOD活性(F=57.974; df=4,10;P<0.001)影响显著，其活性均显著高于对照。其中，37℃处理的SOD活性最高，较25℃时增加了97.41%，随着温度进一步升高，SOD活性有所下降，在40℃～46℃范围内，各处理间SOD活性仍然显著高于对照(图1-A)。

2.2.2筛豆龟蝽成虫CAT活性对高温胁迫的响应

各高温处理对CAT活性(F=14.96; df=4,10;P<0.001)亦有显著影响，各高温处理CAT活性均显著高于对照。37℃～46℃范围内，随着处理温度的升高CAT活性呈逐渐升高趋势，但各处理间无显著差异。在极端高温46℃时，CAT活性最高，较25℃时增高78.97%，较37℃时增高14.90%(图1-B)。

2.2.3筛豆龟蝽成虫POD活性对高温胁迫的响应

在37℃～40℃范围内，各温度处理POD活性(F=12.236; df=4,10;P=0.001)显著高于对照。随着处理温度进一步升高，POD活性显著降低，43℃和46℃处理两者间无显著差异，也分别与对照无显著差异，且POD活性分别较25℃增高20%左右(图1-C)。

图1 不同温度处理对筛豆龟蝽成虫SOD(A)、CAT(B)和POD(C)活性影响

2.3 高温胁迫对筛豆龟蝽成虫体内T-AOC活性的影响

各温度处理对T-AOC活性(F=33.63; df=4,10;P<0.001)影响显著，各高温胁迫处理后其活性均显著高于对照。37℃～46℃范围内，随着处理温度的升高T-AOC活性呈先升高后降低趋势。当温度为40℃时T-AOC活性最高，较对照25℃时增高54.55%，在极端高温46℃时其活性最低，显著低于其它处理，但仍较对照增高22.24%(图2)。

图2 不同温度处理对筛豆龟蝽成虫T-AOC活性影响

2.4 高温胁迫对筛豆龟蝽成虫体内MDA含量的影响

各温度处理MDA含量存在一定差异(F=5.398; df=4,10;P=0.017)。在37℃～46℃范围内，MDA含量与对照无显著差异，随着处理温度的升高MDA含量呈先升高后降低趋势，当温度升高到40℃时MDA含量最高，随着温度进一步升高，MDA含量降低，当温度达到46℃时MDA含量最低，显著低于40℃时MDA的含量，且较对照降低5.58%(图3)。

图3 不同温度处理对筛豆龟蝽成虫MDA含量的影响

3 结论与讨论

在昆虫的长期进化过程中，形成了一系列适应环境温度的保护机制，其中抗氧化酶的应激变化是虫体响应温度胁迫的重要策略之一(Bafanaetal., 2011)。筛豆龟蝽存在世代重叠现象，任何一个发育阶段或整个世代都可能遭遇阶段性高温胁迫，而其成虫有较长的寿命，终生可繁殖(Shietal., 2014)。在本研究中，筛豆龟蝽对高温有较强的耐受能力，46℃以下短时的高温胁迫对其无致死效应，而高温胁迫下筛豆龟蝽成虫的抗氧化酶SOD、CAT、POD、T-AOC活性及MDA含量均发生了不同程度的变化，表现出虫体受到外界高温环境干扰达到一定程度时所产生的应激反应，说明这些抗氧化酶在减轻热应激产生活性氧ROS对虫体的不利影响方面具有积极作用，进而有效提高了对环境高温的适应性。

SOD几乎存在于所有的生物细胞中，是生物体内最重要的抵御氧化胁迫的物质(Celinoetal., 2011)。广聚萤叶甲Ophraellacommuna在短期高温胁迫下，其成虫的SOD活性整体显著升高(Chenetal., 2018)，在对茶淡黄刺蛾Darnatrima的研究中也有类似的现象(李品武等, 2016)。本研究结果显示，筛豆龟蝽在高温胁迫后SOD活性也显著增加，温度超过40℃，SOD活性虽有显著下降，但仍显著高于对照，表明高温胁迫能诱导筛豆龟蝽增强SOD活性，从而提高筛豆龟蝽的耐热能力。

CAT和POD均能清除昆虫体内过氧化氢(H2O2)，H2O2浓度较高时CAT发挥主要作用，而H2O2浓度较低时POD发挥主要作用，二者共同作用将H2O2维持在较低的水平(Lietal., 2003)。筛豆龟蝽受温度胁迫后POD和CAT活性同时增加，但在高于43℃后POD活性显著下降而CAT活性无显著变化，双斑长跗萤叶甲Monoleptahieroglyphica的POD活性表现为随温度的升高呈先升高后降低的变化(张志虎等, 2018)。说明在高温37℃～40℃时，筛豆龟蝽体内产生的H2O2主要以CAT和POD共同发挥作用，高于43℃后H2O2浓度较高则主要由CAT清除。

T-AOC是指有机体体内的总抗氧化能力(Ghisellietal., 2000)。筛豆龟蝽成虫T-AOC活性随着胁迫处理温度的升高，表现为先增加而后降低，但均显著高于对照，表明筛豆龟蝽成虫在高温条件下诱导的抗氧化反应较多。T-AOC活性在高温40℃时达最高，而SOD和POD在37℃时活性最高，CAT在43℃时最高，T-AOC活性与SOD、POD、CAT活性最大值的胁迫温度并不一致，说明筛豆龟蝽还存在其他的抗氧化机制，在昆虫体内，海山梨醇、海藻糖、热激蛋白等已被发现与抗氧化酶共同抵御活性氧的伤害(Cuietal., 2011；唐维媛等, 2016)。随着温度的升高，T-AOC活性又有所下降，表明部分抗氧化机制可能被抑制。

MDA是脂质过氧化物的主要分解产物，作为氧化应激的一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度(Raeletal., 2004)。本研究结果显示，筛豆龟蝽经高温胁迫后37℃～43℃体内的MDA含量有所增加但差异并不显著，说明MDA的正常水平可能是由于抗氧化酶活性的增强，可以清除多余的脂质过氧化。随着温度的增加，MDA含量总体呈下降趋势，这与高温胁迫对龟纹瓢虫Propylaeajaponica和腐食酪螨Tyophagusputrescentiae的影响结果类似(Zhangetal., 2015; 王静等, 2019)，筛豆龟蝽在较高的温度胁迫下伴随着脂质过氧化和其他对氧化胁迫的反应，抗氧化能力逐渐增强，从而清除了体内过多的活性氧。

综上所述，抗氧化酶在高温胁迫的抗氧化反应过程中发挥着重要作用，筛豆龟蝽成虫可有效处理热胁迫诱导的活性氧进而表现出对环境高温较强的适应性。这与筛豆龟蝽主要分布在中国南方地区的生态学表现是一致的，通过对生态环境的长期适应，形成了自身机体具有较强的耐热性。从本研究筛豆龟蝽成虫可对46℃极端高温仍有相当积极生理响应的结果看，在全球气候持续变暖条件下，高温对该害虫种群分布及在农田发生危害的不利影响是有限的，随着温度的升高，该害虫有可能通过迁移扩散扩大其空间分布范围，危害进一步加重。本研究较全面测定分析了在极端高温条件下筛豆龟蝽抗氧化防御系统的响应，该结果为进一步开展筛豆龟蝽预测预报和在全球气候持续变暖的环境下深入探讨其种群动态变化、分布范围以及其对高温环境适应的分子机制研究提供了科学依据。