蜜蜂残翅病毒在中华蜜蜂及其蜂箱奇露尾甲的发生与进化分析

张丽娜，邓炎春，侯春生*

(1.中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100193；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081)

随着国际贸易日益频繁与种蜂王的交换，蜜蜂感染病原的种类不断增加，新发或再发性病害严重影响蜜蜂的健康。其中，蜂箱奇露尾甲Aethinatumida(鞘翅目：露尾甲科)是一种新的入侵性害虫，能导致蜜蜂群势下降，对规模化养蜂以及野生蜂种群均构成严重的生存威胁(Neumannetal., 2016)。蜂箱奇露尾甲最早在南非被发现，目前已扩散到北美洲、欧洲和亚洲(Neumannetal., 2016)。2017年在我国首次发现蜂箱奇露尾甲入侵我国蜂群，并造成严重的影响，不仅危害蜂群个体与蜂产品(赵红霞等, 2018)，而且携带了多种蜜蜂病毒，包括蜜蜂残翅病毒(Deformedwingvirus, DWV)(赵红霞等, 2019)。

DWV是危害全球蜜蜂种群发展最重要的病毒之一，为正义单链RNA病毒，属于小核糖核酸病毒Picornaviruses家族的传染性软腐病毒科Iflaviridae。DWV主要的结构蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种蛋白组成；非结构蛋白包括解旋酶、3C-蛋白酶(3C-pro)和RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)(Berényietal., 2007)。目前已经确定了三种主要的病毒毒株类型：A型(Eugeneetal., 2014)、B型(Julietteetal., 2004)和C型(Mordecaietal., 2016)。

为明确我国中蜂群寄生的蜂箱奇露尾甲是否携带DWV及其进化关系，本文以同一蜂场不同蜂群的中华蜜蜂Apiscerana和蜂箱奇露尾甲Aethinatumida为样本，通过RT-RCR技术对蜜蜂常见病毒进行检测。由于只检测到了DWV-A，本文将就DWV-A作进一步分析。同时对DWV-A的主要结构蛋白VP3和非结构蛋白RdRp、Lp基因分别进行扩增与测序，探讨DWV-A在同一蜂群同时感染蜂箱奇露尾甲和中蜂时的差异与进化关系。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

实验所用中华蜜蜂和蜂箱奇露尾甲采集于2019年12月5日，采样地点位于四川省普威镇龙潭村蜂场，在蜂场中随机选择3个蜂箱进行采样，其中一号和三号蜂箱蜜蜂和蜂箱奇露尾甲均可采集到，二号蜂箱仅采集到蜜蜂，未采集到蜂箱奇露尾甲。一号、二号和三号蜂箱分别采集蜜蜂50头、一号和三号蜂箱分别采集蜂箱奇露尾甲15头。将采集的蜜蜂和蜂箱奇露尾甲分别置于密封袋内带回，液氮速冻后置于-80℃冰箱长期保存直至用于检测。

1.2 实验材料与试剂

本实验所用RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒Goscript reverse transcription system购自普洛麦格公司(Promega, Madison, WI, USA)，聚合酶2×Es Taq MasterMix购自康为世纪生物科技公司(CW Biotech)，DNA纯化回收试剂盒购自全式金公司(TransGen Biotech)，DNA maker(DL-2029)购于北京美德华生检测技术有限公司，测序及引物合成在上海生工(Sangon, Shanghai)完成，其它化学试剂均为国产分析纯级试剂。

1.3 总RNA的提取及cDNA的合成

分别取5～7头蜜蜂和3头蜂箱奇露尾甲于研钵中加液氮研磨成粉末后取约0.05 g加入含1 mL Trizol溶液的1.5 mL离心管中提取总RNA，所得总RNA用微量核酸蛋白测定仪测定A268/280比值在2.0以上后浓度定量到100 μg/μL，取2 μL用Goscript reverse transcription system反转录试剂盒合成第一链cDNA，所有实验步骤均按说明书要求进行操作。

1.4 RT-PCR检测

反转录所得cDNA取2 μL作为模板进行PCR鉴定以确定其是否感染，所用引物序列及扩增条件分别见表1和表2。

表1 检测DWV-A、B和C型的引物

表2 PCR扩增条件

1.5 核苷酸测序与分析

所得cDNA取2 μL作为模板使用高保真酶进行PCR，所用引物序列及扩增条件分别见表3和表4，将其送生工测序，将获得的序列结果使用NCBI(National Centre for Biotechnology Information)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)与GenBank中的序列进行比较分析。

表3 扩增Lp、RdRp和VP3片段的引物

1.6 系统发育树的构建与分析

选择中华蜜蜂以及其他物种的DWV基因核苷酸序列使用MEGA7.0与ClustalW构建系统发育树，以Tamura-Nei模型(Tamura and Nei, 1993)为基础，采用最大似然法(Maximum Likelihood)对其演化过程进行推断，利用最大复合似然法(Maximum Composite Likelihood, MCL)估计的两两距离矩阵，通过邻域连接和BioNJ算法自动获得启发式搜索的初始树，然后选择具有较优对数似然值的拓扑，分析涉及30多个核苷酸序列，选择的序列及其具体信息如表5所示，所有包含空白和缺失数据的位置都被消除(Kumaretal., 2016)。通过对蜂箱奇露尾甲和中华蜜蜂DWV RdRp、Lp和VP3的克隆与测序，共获得了6条基因序列并提交到NCBI，分别命名为Aethinatumida-RdRp(MT885269)，Aethinatumida-Lp(MT890634)，Aethinatumida-VP3(MT899248)，Apiscerana-RdRp(MT885270)，Apiscerana-Lp(MT890635)，Apiscerana-VP3(MT899249)。

表5 本研究中使用的DWV序列

2 结果与分析

2.1 DWV阳性率及感染情况

利用RT-PCR检测分别检测中华蜜蜂样品3份，蜂箱奇露尾甲样品2份，结果见图1。其中1份中华蜜蜂样品中检测到DWV-A，中华蜜蜂样品阳性检测率为33.3%；2份蜂箱奇露尾甲样品中均检测到DWV-A，蜂箱奇露尾甲样品阳性检测率为100%。中华蜜蜂检测出感染DW-A的蜂群是未采集到蜂箱奇露尾甲的二号蜂群，同时采集到蜜蜂和蜂箱奇露尾甲的一号和三号蜂群中，检测到蜂箱奇露尾甲感染DWV-A，在中华蜜蜂中未检测到。

图1 DWV检测胶图

2.2 DWV系统发育树分析

不同基因片段的进化分析所得到的亲缘关系与进化特点是不同的。基于RdRp和Lp两个基因的核苷酸序列系统进化分析结果(图2)表明，来源于蜂箱奇露尾甲和中华蜜蜂的DWV亲缘关系高达96%，均与胡蜂携带的DWV关系最为密切。而基于VP3基因的核苷酸序列的系统进化表明来源于蜂箱奇露尾甲和中华蜜蜂的DWV的亲缘关系较远，它们分别与无刺蜂和狄斯瓦螨的DWV株更为紧密。

图2 对来源于不同寄主的DWV分离株进化分析

3 结论与讨论

本研究采用四川同一蜂场不同蜂群的中华蜜蜂和蜂箱奇露尾甲作为样本，利用RT-RCR检测其是否感染DWV，结果表明中华蜜蜂和蜂箱奇露尾甲均感染DWV-A，其中中华蜜蜂样品阳性检测率为33.3%，蜂箱奇露尾甲样品阳性检测率为100%。由于本研究的样本量有限，该感染率并不能代表整个蜂群的感染情况。

DWV在全球的蜂群及寄生螨-狄斯瓦螨中具有较高的流行率。为了更深入理解DWV在不同寄主的传播与进化特点，本研究对DWV-A毒株的结构蛋白VP3和非结构蛋白RdRp和L-protein进行了系统发育分析。结果表明不同基因的序列进化树之间有联系也有区别：RdRp和L-protein在进化上与寄主并无太大关系，而VP3片段体现较强的寄主差异性。RdRp对于病毒基因组的复制以及表观遗传控制和细胞基因表达的转录是必不可少的(Ngetal., 2008)，它在病毒进化中具有高度保守性(Elena and Sanjuan, 2005)，病毒种群中该区域突变率的提高可以使宿主根据防御机制和其它环境因素选择性突变(Crottyetal., 2001)。根据本研究的RdRp系统发育分析，感染蜂箱奇露尾甲的DWV并没有形成独立的分支。基于Lp的进化结果与RdRp的相类似，这表明，DWV可能并不依赖于寄主的变化而变化。但是基于VP3基因序列的系统进化分析表明中蜂和蜂箱奇露尾甲的分支并不在同一簇，亲缘关系较远。其结果显示来源于蜂箱奇露尾甲的DWV与狄斯瓦螨的更接近；来源于中蜂的DWV与其它已报道的感染中蜂的DWV更相近。由此推断，蜂箱奇露尾甲的DWV可能来源于狄斯瓦螨，而不是蜜蜂，是否具有较强的致病性需要进一步验证。另一方面，表明DWV的VP3可能对病毒宿主的选择具有重要的作用，以便更好地适应宿主环境。这些推断，仍需对这3个基因的全长作进一步分析才能确定，因为本研究只选择了VP3，L-protein，RdRp 3个基因的部分片段进行的进化分析，可能会导致信息不全面。

DWV在中国以至全球范围内都是非常常见的蜜蜂病毒，且受狄斯瓦螨的影响较大(Wilfertetal., 2016)。在本次检测中DWV-B和DWV-C基因型均未出现，可能是本研究选择的样本量较少。也有可能是该蜂场并未感染DWV-B和DWV-C，因为中华蜜蜂本身感染螨的机率小，即使感染了通过自身的清理行为能有效的清除，使狄斯瓦螨对中蜂并不构成威胁。本研究虽然在蜂箱奇露尾甲中鉴定到DWV，并发现VP3片段在该寄生与中蜂上进化差异，但是VP3的精准致病作用及其特点仍需进一步证实。另外，感染DWV后的蜂箱奇露尾甲是否对中蜂有更大的危害也需进一步鉴定，因为新入侵性物种对本地物种的生态及病原传播都可能产生重要的影响(赵紫华等, 2019)。