黄精质量控制方法改进*

程 闯，胡卫南，方倍倩，颜伟华，宋剑锋，黄 华，郑 明

（浙江省衢州市食品药品检验研究院，浙江 衢州 324000）

黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricumRed.或多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua的干燥根茎，按形状不同，习称“大黄精”“鸡头黄精”“姜形黄精”，春、秋二季采挖，除去须根，洗净，置沸水中略烫或蒸至透心，干燥。2020年版《中国药典（一部）》记载其功能与主治为补气养阴、健脾、润肺、益肾，用于脾胃气虚、体倦乏力、胃阴不足、口干食少、肺虚燥咳、劳嗽咳血、精血不足、腰膝酸软、须发早白、内热消渴等证。目前，多采用九蒸九晒法炮制，可消除生黄精的部分刺激性及毒副作用，增强疗效。现代药理学研究表明，黄精九蒸九晒后其色、香、味等均有变化，黄精多糖抗应激、雄激素样壮阳作用及免疫功能、抗贫血作用均有不同程度增强，毒性明显降低［1－2］。近年来，黄精被大量用于治疗新型冠状病毒肺炎、急性肺损伤、肺结核、肺癌等［3－6］，还具有抑菌、抗炎、抗疲劳、增强免疫等多种生物活性［7－9］，但因其成分复杂、极性较大、水溶性强等特点，难以进行定性和定量分析。现行质量标准以无水葡萄糖为对照品，以蒽酮－硫酸为显色剂，采用紫外－可见分光光度法测定黄精多糖的含量［10］。但该方法操作复杂，重复性差。为了更好地控制黄精药材的质量，避免上市流通的质量参差不齐，亟需建立一种简单、准确、快速的质量控制方法。本研究中采用超高效液相色谱－四极杆飞行时间串联质谱（UPLC/Q－TOF－MS）仪快速筛查出其中的25种化学成分，选择样品中含量稳定、具有代表性的蔗糖、葡萄糖、果糖3种糖类成分，建立了同时测定其含量的高效液相色谱－示差检测器（HPLC－RID）法，以有效控制黄精药材的质量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SCIEX ExionLCTM液相系统，SCIEX X500R QTOF质谱系统（美国SCIEX公司）；Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配有G1322A型真空脱气机，G1311C型四元泵，G1329B型自动进样器，G1316A型柱温箱，G1362A型检测器；Mettler XS205型电子分析天平（梅特勒－托利多公司，精度为0.000 1 g）；JAC 5020型超声波清洗器（功率为500 W，频率为40 kHz）。

1.2 试药

蔗糖对照品（批号为111507－201704，含量为100%），无水葡萄糖对照品（批号为110833－201707，含量为99.9%），果糖对照品（批号为100231－201904，含量为99.6%），均购自中国食品药品检定研究院；水为纯化水，其他试剂均为分析纯。27批次黄精饮片由衢州市内3家企业提供，根据不同工艺处理方法分别编号为Ga，Gb，Gc，各9批。详见表1。

表1 27批次黄精饮片3种工艺处理方法Tab.1 Three processing methods of 27 batches of Polygonati Rhizoma decoction pieces

2 方法与结果

2.1 UPLC/Q－TOF－MS和HPLC－RID条件与分析

2.1.1 UPLC/Q－TOF－MS条件与分析

色谱条件：色谱柱为ThermoScientificC18柱（100mm×2.0 mm，1.9μm）；流动相为2 mmol/L乙酸铵－0.1%甲酸水（A）－甲醇（B），梯度洗脱（程序见表2）；流速为0.2 mL/min；进样量为2μL。

表2 流动相梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution program of the mobile phase

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），负离子模式，质量扫描范围质荷比（m/z）为70～1 300，离子源喷雾电压为4.5 kV，离子源温度为550℃，去簇电压为－50 V，碰撞能量为－35 V，碰撞能量叠加为（－35±15）V，气帘气压力为35 psi，雾化气GS1和辅助气GS2压力均为50 psi，数据采集时间为20 min；正离子模式，质量扫描范围m/z为70～1 300，喷雾电压为5.5 kV，离子源温度为550℃，去簇电压为50 V，碰撞能量为35 V，碰撞能量叠加为（35±15）V，气帘气压力为35 psi，雾化气GS1和辅助气GS2压力均为50 psi，数据采集时间为20 min。

触发二级方法为信息依赖扫描性获取模式（IDA），动态背景扣除（DBS）为触发二级的条件，满足该条件的优先进行二级扫描，共扫描出有代表性的化学物质25种。Qtof共鉴定出25个化学成分，包括异鼠李素－3－O－新橙皮苷、牡荆素鼠李糖苷、薯蓣皂苷元、（6aR，11aR）－3－羟基－9，10－二甲氧基紫檀烷、甲基麦冬二氢高异黄酮B、木犀草素、山柰素、山柰酚、燃料木素、甘草素、5－羟甲基糠醛、1，4苯醌、大黄酸、芦荟大黄素、D－半乳糖、D－甘露糖、无水葡萄糖、亚油酸、水杨酸、水合儿茶素、精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蔗糖、果糖。27批样品中，黄精药材中普遍存在的甲基麦冬二氢高异黄酮B、5－羟甲基糠醛的检出率均为100.00%，薯蓣皂苷元的检出率为80.00%，但不同来源和不同品种黄精含量差异很大；蔗糖、葡萄糖、果糖的检出率均为100.00%，且含量稳定。故最终确定了蔗糖、葡萄糖、果糖3种糖类成分含量的测定方法。

2.1.2 HPLC－RID条件及系统适应性试验

检测器：安捷伦G1362A 1260RID型RID；色谱柱：Carbosep Coregel－87C（钙型）柱（300 mm×7.8 mm，9μm）；流动相：纯水；流速：0.6 mL/min；柱温：80℃；RID光学设备温度：45℃；进样量：10μL。在此色谱条件下，取混合对照品溶液及供试品溶液A，B，C分别进样，结果各待测组分分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000。色谱图见图1。

1.蔗糖 2.葡萄糖 3.果糖 4.黄精多糖A.混合对照品溶液 B.供试品溶液A（水提取物） C.供试品溶液B（80%乙醇回流提取物） D.供试品溶液C（残渣提取物）图1 高效液相色谱图1.Sucrose 2.Glucose 3.Fructose 4.Polygonatum polysaccharideA.Mixed reference solution B.Test solution A（water extract）C.Test solution B（80% ethanol reflux extract）D.Test solution C（residue extract）Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液

取蔗糖、葡萄糖、果糖对照品适量，精密称定，置50mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL分别含蔗糖0.5 mg、葡萄糖0.5 mg、果糖0.5 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液

水提取物：取样品1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水100 mL，密塞，摇匀，浸泡30 min，超声处理（＜40℃）30 min，取出，立即过滤，弃去初滤液，即得供试品溶液A。

80%乙醇回流提取物：取样品1 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中加热回流1 h，趁热过滤，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，收集80%乙醇提取物，即得供试品溶液B。

残渣提取物：取80%乙醇回流提取物项下残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热过滤，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，合并滤液与洗液，即得供试品溶液C。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取蔗糖、葡萄糖、果糖对照品各适量，精密称定，分别用水溶解成质量浓度为0.486 9，0.243 4，0.595 7 mg/mL的混合对照品贮备液，精密吸取混合对照品贮备液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00 mL，分别置20 mL容量瓶中，加水定容，即得系列混合对照品溶液。精密量取上述不同质量浓度的混合对照品溶液，按2.1.2项下色谱条件进样测定，以峰面积（Y）为纵坐标、对照品溶液质量浓度（X，mg/mL）为横坐标进行线性回归。结果见表3，表明蔗糖、葡萄糖、果糖均在各自质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

检测限和定量限确定：取同一批样品（编号为Ga 5），依法制备供试品溶液，用水稀释，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以信噪比（S/N）为3时的质量浓度为检测限，以S/N为10时的质量浓度为定量限。结果见表3。

精密度试验：取2.2.1项下混合对照品溶液适量，按2.1.2项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果见表3，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批样品（编号为Ga 5），依法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，4，8，12，24，48 h时进样测定，记录峰面积。结果见表3，表明供试品溶液在常温下48 h内稳定。

重复性试验：取同一批样品（编号为Ga 5），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.1.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果见表3，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品（编号为Ga 5）1 g，精密称定，共9份，依法制备供试品溶液，平均分为3组，按高、中、低浓度（150%，100%，50%）分别加入一定量的蔗糖、葡萄糖、果糖对照品，按2.1.2项下方法进样10μL测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表3。

A.蔗糖 B.葡萄糖 C.果糖图2 不同蒸制次数黄精饮片中3种糖类成分的含量变化A.Sucrose B.Glucose C.FructoseFig.2 Content change of three sugar components in Polygonati Rhizoma prepared with different steaming and sun－drying times

耐用性试验：选择不同柱温、流速、流动相pH、品牌钙型色谱柱测定同一批样品（编号为Ga5）的含量。结果表明，色谱柱温度为（80±1）℃，流速为（0.6±0.1）mL/min，流动相pH介于5.5～7.0时，测定结果稳定，若样品峰面积过大，应稀释至合适浓度再进样。

2.4 样品含量测定

取27批样品，每批取3份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1.2项下条件进样测定，按线性回归方程计算各成分的含量。结果见表4。

表4 27批不同蒸制次数黄精饮片中3种糖类成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.4 Content determination of three sugar components in 27 batches of Polygonati Rhizoma prepared with different steaming and sun－drying times（mg/g，n＝3）

2.5 不同蒸制次数的黄精小分子糖含量测定

取27批次3种不同工艺制备的黄精饮片，依法制备供试品溶液，依法进样测定，绘制蔗糖、葡萄糖、果糖的含量变化趋势图（见图2）。结果蔗糖含量在三制时达到顶峰，然后逐渐降低；葡萄糖和果糖含量在七制前逐步升高，七制后趋于稳定。

3 讨论

由图2可知，3种不同工艺、不同蒸制次数黄精小分子糖的含量变化趋势，可以指导药企优化改良黄精蒸制工艺，在提高黄精饮片质量方面取得了进展。

现行黄精质量标准中用80%乙醇回流提取进行含量测定，由图1可知，80%乙醇除将黄精中的单糖、二糖等小分子糖提取出来外，也提取了大量黄精多糖，故不能准确反映原黄精饮片中的多糖含量，且该方法加样回收试验难度较大。按此方法检测，结合图2黄精多糖的含量变化趋势分析，现有产品中不合格率高达80%。而黄精近年来曾被作为国考核和省考核品种，皆因其含量测定方法有待商榷而无法出具含量测定报告，故黄精的含量测定标准需提高。

本研究中建立的HPLC－RID法操作简便，缩短了分析时间，结果准确，重复性、回收率、稳定性、耐用性均较好，蔗糖、葡萄糖、果糖在以上27批样品中均检出，且含量较高，数值稳定，可用于黄精饮片的质量控制。下一步将结合药效提升检测质量。