湖北恩施土家族药物豆板还阳中3种成分含量测定研究*

张万涛，郑 露，涂 星

（1.湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学医学部，湖北 恩施 445000；3.风湿病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；4.湖北民族大学武陵山中药材检验检测中心，湖北 恩施 445000）

豆板还阳为苦苣苔科吊石苣苔属植物吊石苣苔Lysionotus pauciflorusMaxim.的干燥地上部分，又称石吊兰、石豇豆、岩泽兰、石泽兰、岩豇豆、岩石茶等，是土家族“七十二还阳”药物之一，收载于2020年版《中国药典（一部）》，含量测定以石吊兰素为指标成分，具有化痰止咳、软坚散结功效，用于治疗咳嗽痰多、瘰疬痰核［1－3］。其主要含有黄酮类、挥发油类、植物甾醇和三萜皂苷类、苯丙素苷类等多种成分［4－7］，具有抗结核、抗炎、降压、止咳化痰、清除自由基、抗粥样动脉硬化、抗肿瘤等作用［8－10］。文献［11－14］中对贵州、云南等地区的石吊兰进行了含量测定与研究，但少见湖北恩施土家族豆板还阳的相关报道。本研究中建立了湖北省恩施8个产地豆板还阳药材中阿魏酸、槲皮素、石吊兰素含量的高效液相色谱（HPLC）法，并比较了不同产地的含量差异，为土家族药物豆板还阳药用资源的开发、利用和保护提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－2030C型液相色谱仪（日本岛津公司），配有二极管阵列（PDA）检测器；VS－100UE型恒温超声提取仪（无锡沃信仪器制造有限公司）；BT－25S型电子分析天平（精度为0.01 mg），BSA224S－CW型电子分析天平（精度为0.1 mg），均购自德国赛多利斯公司；MilliQ型超纯水系统（贝徕美生物科技有限公司）。

1.2 试药

阿魏酸对照品（批号为110773－201614，含量为99.0%），槲皮素对照品（批号为100081－201610，含量为99.1%），石吊兰素对照品（批号为111555－200602，含量为98.1%），均为色谱纯，购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈（色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司）；水为去离子超纯水，其余试剂均为分析纯。豆板还阳药材采自湖北恩施不同地区，采集方式均为野外采集，去杂质，晒干，经湖北民族大学医学部朱敏英副教授鉴定为正品。样品来源信息见表1。

表1 湖北恩施豆板还阳样品来源信息Tab.1 Source information of Lysionoti Herba in the Enshi City，Hubei Province

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：岛津InertSustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～25 min时15%A，25～55 min时15%A→52%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：332 nm；柱温：30℃；进样量：10μL。在此色谱条件下的色谱图见图1。

1.阿魏酸 2.槲皮素 3.石吊兰素A.混合对照品溶液 B.供试品溶液图1 高效液相色谱图1.ferulic acid 2.quercetin 3.lysionotinA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

2.2 溶液制备

取阿魏酸、槲皮素、石吊兰素对照品各10 mg，精密称定，分别置100 mL容量瓶中，分别加75%甲醇，制成质量浓度为100μg/mL的溶液，摇匀，即得对照品贮备液。取粉碎后的样品粉末0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率为240 W，频率为45 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取2.2项下阿魏酸、槲皮素、石吊兰素对照品贮备液，加入75%甲醇，稀释为系列质量浓度的混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。以对照品溶液的质量浓度为横坐标（X）、峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程。结果见表2。

表2 3种成分线性关系考察结果（n＝6）Tab.2 Results of the linear relation test of three components（n＝6）

精密度试验：取2.2项下对照品贮备液，按2.1项下色谱条件重复进样6次，测定峰面积。结果阿魏酸、槲皮素、石吊兰素峰面积的RSD分别为0.45%，0.47%，0.17%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号为S7），精密称定，依法制备供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10，18，24 h时进样测定。结果阿魏酸、槲皮素、石吊兰素峰面积的RSD分别为2.01%，1.82%，2.30%（n＝8），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取样品（编号为S7）精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定。结果阿魏酸、槲皮素、石吊兰素峰面积的RSD分别为1.73%，1.51%，0.91%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（编号为S7）1 g，精密称定，共6份，按与已知成分含量1∶1（m/m）的比例分别加入阿魏酸、槲皮素、石吊兰素对照品溶液，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 样品含量测定

取不同产地的豆板还阳药材，分别制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定3次，以峰面积计算豆板还阳中3种成分的含量。结果见表4。

表4 不同产地豆板还阳中3种成分含量测定结果（%，n＝3）Tab.4 Determination results of three components in Lysionoti Herba in different producing areas（%，n＝3）

2.5 聚类分析

将8个不同产地的豆板还阳药材含量测定结果导入SPSS 21.0统计学软件，采用聚类方法选择组间联接，区间采用平方Euclidean距离，得到8个不同产地的药材聚类分析树状图，详见图2。可见，当距离（d）为8时，可分为三类，即鹤峰县走马镇（S8）单独聚为Ⅰ类，利川市建南镇（S5）、建始县花坪乡（S6）、宣恩县椿木营乡（S3）聚为Ⅱ类，宣恩县长潭河乡（S1）、宣恩县七姊妹山（S2）、咸丰县高乐山镇（S4）、宣恩县高罗镇（S7）聚为Ⅲ类。

图2 8个不同产地的药材聚类分析树状图Fig.2 Dendrogram of cluster analysis of medicinal materials from eight different producing areas

3 讨论

3.1 测定条件选择

检测波长：本研究中所用的PDA检测器可实现多波长同步分析，经等高线图与光谱图分析后得出，石吊兰素最大吸收波长为332 nm，与2020年版《中国药典（一部）》中石吊兰项下检测波长一致，槲皮素与阿魏酸在该波长下也有较强吸收，故选择332 nm作为检测波长。

流动相：根据文献［2，13－16］，选择不同流动相［乙腈－0.05%磷酸、甲醇－1%醋酸（梯度洗脱），甲醇－1%醋酸（85∶15，V/V）、甲醇－水（68∶32，V/V）、甲醇－0.05%磷酸（68∶32，V/V）］，通过考察并综合试验成本、操作方法简便性等，最终选择乙腈－0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，检测时长较短，峰形较好，与杂质峰分离度较好。

色 谱 柱：最初选择InertSustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），试验发现所有色谱峰均拖尾，经推测可能是由色谱柱柱头污染导致。换用新的Inertsustain C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），所有色谱峰拖尾消失，但检测时间较长，与InertSustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）比较后，最终选择InertSustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）。

3.2 聚类分析结果指导产地药用资源开发与利用

对恩施地区8个产地豆板还阳药材中3种成分的含量测定后发现，各产地间成分差异较大，只有咸丰县高乐山镇（S4）、宣恩县高罗镇（S7）、鹤峰县走马镇（S8）的样品中同时检测出阿魏酸、槲皮素、石吊兰素3种成分，且阿魏酸、槲皮素含量均较低，8个产地豆板还阳中石吊兰素的含量均达到2020年版《中国药典（一部）》要求的1～3倍。结合含量测定及聚类分析结果，恩施地区的豆板还阳以鹤峰县走马镇所产为佳，可为豆板还阳药用资源的开发、利用和保护提供参考。

3.4 方法评价

2020年版《中国药典》中以石吊兰素为指标性成分控制豆板还阳的药材质量，质控指标单一。中药的成分复杂多样，功效多种多样，故多成分含量测定的质控指标较单一成分能更好地反映药材质量［17－19］。本研究中首次建立了同时测定豆板还阳中3种成分含量的HPLC法，并比较了不同产地3种成分的含量差异，可为提高现行质量标准和全面控制豆板还阳药材质量提供参考。值得注意的是，编号为S1，S2，S3，S5豆板还阳样品中几乎没有测出槲皮素，编号为S3，S5，S6豆板还阳样品中几乎没有测出阿魏酸；尤其是S3和S5，既不含阿魏酸，也不含槲皮素。因此，将阿魏酸和槲皮素作为豆板还阳药材定量分析的指标性成分还值得商榷。导致产地间成分差异的原因复杂多样，有可能与样品的生长环境、年限、采收时间、采收后的加工贮存、检验检测方法等因素有关，还有待进一步研究。