鳙鱼骨酶解产物的抗氧化活性及相对分子质量分布

董 烨，张益奇，2，3，姚洪正，何光喜，戴志远，2，3*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310035 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310035 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连116000 4 杭州千岛湖发展集团有限公司 杭州311701）

水产加工过程中通常产生大量的副产物，如鱼鳞、鱼鳍、鱼皮、鱼骨及内脏等，约占活鱼体重的50%～70%[1-2]，其中，鱼骨含有丰富的胶原蛋白、钙和磷等营养成分。然而，鱼骨质构坚硬，内部的胶原蛋白由3 条螺旋链缠绕而成，基质附着羟基磷灰石，较难利用[3]。我国目前对鱼骨的开发利用技术较为落后，大多数被直接丢弃，导致环境问题和宝贵营养物质的浪费。利用一些新技术手段对这些低值鱼骨进行高值化、生态化利用具有一定的意义。

酶解法制备鱼类蛋白生物活性物质是近年来研究的热点，如Garcia-moreno 等[4]研究了不同DH 蓝鳕鱼酶解产物的抗氧化活性、ACE 抑制活性和抗原性。Lima 等[5]研究了不同DH 石首鱼副产物酶解产物的抗氧化和抗菌活性。李军等[6]酶解鲢鱼骨，分离纯化得到具有高抗氧化活性的胶原多肽。水产品加工过程中产生的副产物通常作为制备酶解产物的来源。然而，作为副产物之一的鱼骨，其内部胶原蛋白分子通过次级键形成稳固的结构，并与羟基磷灰石牢固结合，包埋了酶的催化位点，导致酶解效率低下。因此亟需探索一些简单高效的鱼骨预处理方法。汽爆技术是一种物理化学预处理技术，可以破坏材料结构，从而提高酶解效率[7]。将原料在高压蒸汽中保压一段时间后瞬时泄压，饱和蒸汽急剧膨胀而绝热做功，产生的冲击波对原料进行机械剪切，解离原料组分间的紧密结构[8]。因汽爆技术投资成本低，能耗低且绿色环保，在原料预处理中得到广泛的应用[9-11]。本文以鳙鱼骨为原材料，采用汽爆技术预处理鱼骨，酶解制备不同水解度的鱼骨酶解产物，评估鱼骨酶解产物的抗氧化活性，探究鱼骨酶解产物分子质量分布情况，为鱼骨资源高值化的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鳙鱼骨，杭州千岛湖；中性蛋白酶，源叶生物技术有限公司；复合蛋白酶、碱性蛋白酶3.0T、风味蛋白酶，诺维信公司；木瓜蛋白酶、三氯乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、水杨酸、氯化亚铁、氯化铁、30%过氧化氢、95%乙醇、铁氰化钾，国药集团化学试剂有限公司；DPPH、ABTS、马尿酰-组氨酰-亮氨酸（429 u）、碳酸酐酶（29 ku）、细胞色素C（12.4 ku）、抑肽酶（6.5 ku）等，美国Sigma 公司。

1.2 试验仪器与设备

e2695 高效液相色谱，美国Waters 公司；FE20 pH 计，梅特勒仪器有限公司；SPECTRA MAX190酶标仪，美国Molecular Devices 公司；QBS 200B汽爆机，正道生物能源公司；紫外-可见分光光度计、Fresco 21 冷冻高速离心机，美国Thermo Fisher 公司；400Y 多功能粉碎机，永康铂欧五金制品有限公司；DGG-9123A 电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；Ultra-Turrax T-18 basic 均质机，德国IKA 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 汽爆处理[8]用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡鱼骨去除杂蛋白，每隔2 h 更换1 次浸泡液，浸泡4 h 后，将鱼骨取出洗至中性，沥干备用。将汽爆机预热，至压力为0.6 MPa。取200 g 鱼骨置汽爆机内，保压2 min 后瞬间泄压（前期通过对不同汽爆条件鱼骨酶解特性的研究发现，当汽爆压力0.6 MPa，保压时间2 min 时，酶解效果较好），收集汽爆后的鱼骨置40 ℃干燥箱烘干后粉碎，于-20 ℃保存待用。

1.3.2 酶解试验 采用碱性蛋白酶（50 ℃，pH 8.0）、木瓜蛋白酶（50 ℃，pH 7.0）、复合蛋白酶（50℃，pH 7.0）、中性蛋白酶（50 ℃，pH 7.0）和风味蛋白酶（50 ℃，pH 7.0）5 种蛋白酶，在各自最适条件下进行酶解反应。将6%汽爆鱼骨粉溶液均质5 min，水浴加热至各蛋白酶对应的最适温度，用0.05 mol/L NaOH 调节至最适pH 值，蛋白酶添量为2%，开始反应并计时，反应过程中滴加0.05 mol/L NaOH 维持蛋白酶的最适pH 值，同时记录NaOH 溶液的消耗量。通过消耗的NaOH 量计算DH，评价各蛋白酶的酶解效果。

1.3.3 水解度（DH）的测定 采用pH-stat 法[12]测定水解过程中的NaOH 消耗量，计算酶解产物的DH。

式中：B——消耗NaOH 体积，mL；Nb——NaOH 浓度，mol/L；α——α 氨基的解离度；MP——底物中蛋白质总量，g；htot——底物中蛋白质肽键总数，mmol/g。

1.3.4 不同DH 的鱼骨酶解产物的制备 使用碱性蛋白酶和复合蛋白酶制备不同DH 的鱼骨酶解产物，分别记为HA 和HP。通过控制NaOH 消耗量来制备不同DH 的酶解产物。当DH 分别达到5%，10%，15%时，停止滴加碱液，置沸水浴中灭酶10 min，8 000 r/min 离心15 min，取上清液（分别记为HA5、HA10、HA15、HP5、HP10 和HP15），冷冻干燥，备用。

1.3.5 抗氧化活性评价

1.3.5.1 DPPH 自由基清除率的测定 参考Chen等[13]方法，稍作修改。取将1 mL DPPH 溶液（0.15 mmol/L），与1 mL 酶解液混合，室温（25 ℃）下避光静置30 min，在波长517 nm 处测定该混合物的吸光度A1，将1 mL 酶解液与1 mL 95%乙醇混合后测定其吸光度A2，1 mL 超纯水与1 mL DPPH 乙醇（95%）混合后测定其吸光度A3。计算DPPH 清除率公式：

1.3.5.2 ABTS 自由基清除率的测定 参考Ketnawa 等[14]方法配制ABTS 母液，于室温避光反应12～16 h，用pH 7.4 的0.2 mol/L PBS 缓冲液稀释ABTS 母液，使其在波长734 nm 处的吸光值为0.7±0.02。移取50 μL 样品与150 μL ABTS 溶液于96 孔酶标板上混匀，室温下避光反应6 min后，于波长734 nm 处测定吸光值（A1）。用50 μL超纯水代替样品的反应体系为控制组（A2），以150 μL PBS 代替ABTS 溶液的反应体系为样品空白组（A3），以50 μL 超纯水和150 μL PBS 缓冲液分别代替样品和ABTS 溶液的反应体系为空白组（A4）。

1.3.5.3 羟基自由基清除率的测定 参考崔帅[15]的方法，稍作修改。依次加入350 μL 超纯水、50 μL 9 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液、50 μL 样品、50 μL 9 mmol/L 的氯化亚铁溶液、50 μL 8.8 mmol/L过氧化氢溶液，混匀后于37 ℃保温15 min，在波长510 nm 处测溶液的吸光度。A1为样品的吸光度；A2为50 μL 超纯水代替氯化亚铁溶液测得的吸光度；A3为50 μL 超纯水代替样品测得的吸光度。

1.3.5.4 还原力的测定 参考贾韶千等[16]的方法，移取200 μL 样品与500 μL 1%铁氰化钾溶液混合，50 ℃水浴20 min，加入500 μL 10% TCA 终止反应。将反应液以6 000 r/min 离心5 min，取上清液500 μL 于离心管中，分别加入500 μL 超纯水和200 μL 0.1%氯化铁溶液，摇匀后置50 ℃水浴10 min。取200 μL 溶液于波长700 nm 处测定吸光值。将200 μL 超纯水代替氯化铁作为空白对照。

1.3.6 相对分子质量 参照Zhang 等[17]的方法，采用Waters e2695 高效液相系统，色谱柱为TSKgel G2000 SWxl（7.8 mm×300 mm，Tosoh），UV/Vis 检测器，检测波长220 nm，洗脱液为45%乙腈-55%水溶液（0.1% TFA），0.5 mL/min 等度洗脱，时间30 min，进样量10 μL。采用细胞色素C、碳酸酐酶、抑肽酶和马尿酰-组氨酰-亮氨酸作标准品。以分子质量的对数（lgM）为纵坐标，各标准品保留时间（t）为横坐标作图，通过标准曲线计算样品相对分子质量分布情况。

1.4 数据处理

用OriginPro2018 作图，SPSS 21.0 软件处理数据，以平均数±标准差（±s）表示，用多重比较分析法进行显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶对鳙鱼骨的酶解效果

水解度（DH）可作为肽键断裂的一个指标[18]。不同种类的蛋白酶的底物特异性和作用的酶切位点不同，导致酶解产物DH 和氨基酸序列不同，从而影响产物的结构、组成和功能[19]。由图1 可知，DH 随酶解时间的延长逐渐增大，在前30 min DH增加较快，随后逐渐趋于平缓，这可能是由于随着酶解的进行，有效酶切位点逐渐减少。不同蛋白酶对鱼骨的酶解效果差异较大，碱性蛋白酶处理的水解产物的DH 最高，在300 min 时达21.03%，其次为复合蛋白酶，而风味蛋白酶处理的酶解产物的DH 最低。最终选择碱性蛋白酶和复合蛋白酶作为后续鱼骨酶解用酶。

图1 蛋白酶对鱼骨水解度的影响Fig.1 Effect of proteases on DH of fish bone

2.2 鱼骨酶解产物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH 是一种大分子自由基，反映酶解产物的自由基清除能力，是评价酶解产物体外抗氧化能力的重要指标[20]。不同酶的酶解产物的氨基酸序列不同，对DPPH自由基的清除能力也不同。由图2 可看出，碱性蛋白酶酶解产物（HA）和复合蛋白酶酶解产物（HP）对DPPH 自由基的清除活性均随样品浓度的增加而显著增加（P＜0.05）。HP 对DPPH 自由基的清除活性高于HA，这可能是由于复合蛋白酶获得的酶解物具有更强的供氢作用，从而对DPPH 自由基具有更好的清除活性。当DH 为10%时，HP 表现出较强的DPPH 自由基清除率，其IC50值为2.85 mg/mL，而HA10 的IC50值为6.67 mg/mL，差异显著（P＜0.05），表明HP10 中含有较多的抗氧化组分。

图2 不同水解度鱼骨酶解产物的DPPH 自由基清除率Fig.2 DPPH scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

2.2.2 ABTS 自由基清除能力 ABTS 自由基清除法常用于评价亲水性和亲脂性化合物的抗氧化活性[21]。图3 显示不同DH 条件下酶解产物的ABTS自由基清除能力，表明ABTS 自由基清除活性受酶解液浓度的影响，在试验浓度范围，随着酶解液浓度的增大，其清除活性增大，具有一定的量效关系。随着DH 的增大，两种酶解物对ABTS 自由基清除能力呈先增大后减小的趋势。HP10 具有较好的ABTS 自由基清除能力，这与DPPH 自由基清除能力的结果相同。酶解产物清除自由基的能力不仅与肽链的分子质量大小有关，还与酶解过程中所用酶的特异性有关[22]，在同一DH 下，HP10 的IC50值为0.99 mg/mL，而HA10 的IC50值为1.59 mg/mL，差异显著（P＜0.05）。从两种酶解产物对ABTS 自由基清除能力的IC50值可看出，酶解产物对ABTS 自由基的清除能力优于DPPH 自由基清除能力，这与Latorres 等[23]的研究结果一致。

图3 不同水解度鱼骨酶解产物的ABTS自由基清除率Fig.3 ABTS scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

2.2.3 羟自由基清除能力 羟基自由基可与生物体内的任何物质发生反应，特别是与蛋白质、DNA和脂类等大分子物质，会导致细胞衰老、癌症和一些疾病的发生[24]，因此，清除羟基自由基对生物体至关重要。HA 和HP 不同DH 清除羟基自由基的能力如图4所示。羟基自由基清除能力与酶解液浓度呈正相关。当酶解液质量浓度为6 mg/mL 时，HA15（54.40%）具有与HP15（54.96%）相似的羟基自由基清除能力。HA 对羟基自由基的清除能力随DH 的增加而增加，HA15 的IC50值为7.09 mg/mL，而HP 对羟基自由基清除能力随DH 呈先增大后减小趋势，这与ABTS 自由基清除能力相似。HP10 羟基自由基清除能力较高，IC50值为4.91 mg/mL，而HA10 的IC50值为8.33 mg/mL，差异显著（P＜0.05）。

图4 不同水解度鱼骨酶解产物的羟自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging activity of fish bone hydrolysates with different DHs

2.2.4 还原力的测定 Fe3+还原试验常用于评价抗氧化剂提供电子或氢将Fe3+还原为Fe2+的能力，具有抗氧化活性的小分子肽和氨基酸的存在会影响样品的还原能力[25]。酶解产物的还原能力可用来测量其抗氧化能力，在波长700 nm 处，吸光度值越大，酶解产物的还原力越强，其抗氧化能力越高。如图5所示，所有酶解产物的还原力水平均随浓度的增加而增加。在相同浓度下，HA 的还原力高于HP。HA15 的还原能力最强，当质量浓度为8 mg/mL 时其吸光度值为0.75。酶的种类影响酶解产物的还原能力，在相同的DH 下，HA 和HP 酶解物还原能力差异显著（P＜0.05）。在HA 体系，酶解物随DH 的升高，还原力显著增强（P＜0.05）。而在HP 体系，DH 对其还原力影响不大（P＞0.05）。

图5 不同水解度鱼骨酶解产物的还原能力Fig.5 Reducibility of fish bone hydrolysates with different DHs

2.3 分子质量分布

测定了6 种酶解产物的分子质量分布。将其分为4 个部分：＞1 500 u、1 000～1 500 u、1 000～200 u 和＜200 u。由图6 可知，随着水解程度的加大，酶解产物的分子质量发生显著变化，大分子肽的比例下降，小分子肽的比例上升（P＜0.05）。由图7 可知，当水解度达15%时，HA15 和HP15 的分子质量在1 000 ～200 u 的比例分别达到96.92%和85.95%，酶解效果较好。这是由于随着酶解时间的增加，蛋白质分子间的肽键不断断裂，形成越来越多的小分子肽，分子质量减小。

图6 鱼骨酶解物的分子质量分布色谱图Fig.6 Chromatogram of molecular weight mass distribution of fish bone hydrolysates

图7 鱼骨酶解物的分子质量分布Fig.7 Distribution of molecular weight of fish bone hydrolysates

3 结论

以汽爆鳙鱼骨为原料，以DH 为指标，筛选出碱性蛋白酶和复合蛋白酶两种蛋白酶酶解汽爆鱼骨粉，制备不同DH 的鱼骨酶解液，研究其抗氧化活性及分子质量分布。结果表明，不同DH 的鱼骨酶解物的抗氧化活性随酶解产物浓度的增大而增强，呈现良好的量效关系。HA 具有较好的还原能力，而HP 具有较好的DPPH 自由基、ABTS 自由基和羟自由基清除能力，当DH 为10%时，HP10对这3 种自由基清除率的IC50值分别为2.85，0.99 mg/mL 和4.91 mg/mL，分子质量主要分布在500 u以下，达75.08%。在还原力和羟自由基体系，随着DH 的增加，HA 的抗氧化活性随DH 的增大而逐渐增强，而HP 与DH 之间没有显著的一致性规律。在ABTS 体系，HA 和HP 的抗氧化活性随DH的增大呈现先增强后减小的趋势。随着DH 的增大，蛋白质间的肽键不断断裂，大分子逐渐降解，HA 和HP 的小分子质量肽不断增多。鱼骨质构坚硬，利用率低，采用汽爆技术预处理鱼骨，研究其酶解产物的抗氧化性，可为提高鱼骨资源利用率提供理论依据。今后还需开展汽爆处理对鱼骨结构影响及酶解产物应用的研究。