青钱柳水提物降血糖及抗发炎功效研究

李 燕，蔡儒安，潘如梨，陈佑儒，郑晓杰，谢登恩

（1 温州科技职业学院（温州市农业科学研究院）温州市特色食品资源工程技术研究中心 浙江温州325006 2 台湾大仁科技大学 台湾屏东90741 3 台湾大仁科技大学药学研究所 台湾屏东90741）

糖尿病是因胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗而产生的以高血糖为特征的代谢性疾病。目前全球约有4.25 亿糖尿病患者，预计到2045年，患有糖尿病的人数将达到6.29 亿人[1]。我国是糖尿病第一大国，据统计，成年糖尿病患者人数约1.14 亿，其中2 型糖尿病患者占90%以上[2]。目前，糖尿病已经成为继肿瘤、心血管疾病后在世界范围内的第三大严重危害人类健康的非传染性疾病[3-4]。

青钱柳（Cyclocarya paliurus）为金钱李或金钱柳，系双子叶植物纲胡桃科青钱柳属落叶乔木，是我国濒临灭绝的珍稀树种之一，属国家二级保护树种，主要生长于我国南部亚热带的山区，分布于广西、江西、湖南、浙江、福建、四川等省[5]。大量研究表明，青钱柳富含多糖、黄酮、皂苷等活性成分，其提取物具有降血糖、降血脂、降血压等功效。2013年，青钱柳叶被国家卫生和健康委员会列入新资源食品目录[6]。以青钱柳叶为原料研制的保健茶，成为我国第一个获得美国FDA 认可的保健茶。青钱柳因广泛的药用和食用价值具有良好的市场前景。

青钱柳作为具有降血糖功效的功能性食品原料，近年来备受关注。本试验以青钱柳叶为原料，用水浸提获得粗提物，研究青钱柳水提物对胰腺细胞的增殖作用，并通过链脲佐菌素/烟酰胺（STZ/NA）诱导建立预防型2 型糖尿病小鼠模型，用青钱柳水提物灌胃4 周，观察糖尿病小鼠血糖、血脂等指标的变化，研究该水提物对糖尿病小鼠的抗发炎和预防糖尿病的作用，为青钱柳的精深加工及在保健食品中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康ICR 品系小鼠，雄性，4 周龄，20.0～25.0 g，购自台湾乐斯科生物科技股份有限公司，饲养于台湾大仁科技大学动物中心，具空调设备，温度维持在（25±1）℃，相对湿度（55±5）%，喂以市售饲料，自由进水，适应一周后开始进行试验。

1.2 材料与试剂

青钱柳叶，由浙江省文成县青钱柳种植合作社提供。

RIN-m5F 细胞为大鼠胰岛β 细胞瘤细胞，购于台湾食品工业发展研究所生物资源保存研究中心。烟碱酸（NA）、链脲佐菌素（STZ）、格列本脲（Gly）、DMSO、胰蛋白酶、MTT、佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）、吲哚美辛（Indomethacin），美国Sigma 公司；RPMI 1640 培养基，美国Hyclone；血糖试纸，德国贝朗有限公司。

1.3 主要仪器与设备

SB-1000 旋转蒸发仪，日本Eyela；无菌操作台，台湾Tsai Hsin；BC2D 循环恒温水浴槽，台湾Hipoint；NU-4750 CO2培养箱，美国NuAire；Gs-300fl 倒立荧光显微镜，日本Mirage；MX-305 高速离心机，日本Tomy；Mqx-200 酶联免疫分析仪，美国Biotek；HA330 杀菌斧，台湾Hipoint；血糖仪，德国Omnitest Plus；测厚仪，日本Peacock。

1.4 试验方法

1.4.1 青钱柳水提物制备 取200.0 g 青钱柳干叶加入3 L 的蒸馏水中，以水煎煮2 次，合并滤液，将过滤液通过旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液进行冷冻干燥得到青钱柳粉末30 g，得率为15%。冷藏条件下保存，使用时用纯水溶解，配制成所需浓度溶液。

1.4.2 MTT 法测定青钱柳水提物细胞增殖试验称取30.0 mg MTT，加入6.0 mL 磷酸盐缓冲液，配制成质量浓度为5.0 mg/mL 的MTT 溶液，并保存于4 ℃冰箱备用。将处于对数生长期的RINm5F 细胞进行计数，以104个/孔接种于96 孔盘中，接种体积为200 μL/孔，于37 ℃培养12～16 h后移除旧培养基，再加入100.0 μL 无血清培养基，分别含0.0，25.0，50.0，100.0，250.0 及500.0 μg/mL 质量浓度的青钱柳，再培养12～48 h，于每个孔中加入30.0 μL 5 mg/mL 的MTT 溶液，于37℃含5% CO2的培养箱中避光反应3 h。向每孔中加入150.0 μL 的DMSO，避光振荡10 min 后，用酶联免疫分析仪在490 nm 检测吸光值（OD）。

细胞增殖率（%）＝[（试验组OD 值-对照组OD值）/对照组OD 值]×100

1.4.3 降血糖分组及给药 取健康ICR 小鼠，适应性饲养1 周，禁食不禁水12～14 h 后，称重，根据体重S 型分组，分为6 组：空白对照组（Control组）、诱发组（STZ 组）、阳性药对照组（Gly 组）、青钱柳低剂量组（L 组）、青钱柳中剂量组（M 组）和青钱柳高剂量组（H 组）。空白对照组和诱发组给予纯水，阳性药对照组予格列本脲（Gly），青钱柳低、中、高剂量组分别给予青钱柳样品（剂量分别为100.0，200.0，500.0 mg/kg），每天灌胃给药1 次，连续28 d。

1.4.4 STZ/NA 诱发糖尿病小鼠模型 第1 次灌胃样品后，进行诱发糖尿病试验：诱发组、阳性药对照组和青钱柳低、中、高剂量组分别腹腔注射NA（剂量为200.0 mg/kg）保护小鼠胰脏，30 min后，腹腔注射诱发糖尿病药物STZ（剂量为120.0 mg/kg）；空白对照组对应腹腔注射2 次生理盐水（剂量为10.0 mL/kg）。4 d 后将STZ 剂量减半，其它操作相同，进行第2 次诱发。再过1 周后，采用尾部静脉取血测定诱发组小鼠空腹血糖值，根据空腹血糖数值，判断是否诱发成功。

1.4.5 血清生化指标的检测 给药试验结束后，禁食12～14 h，CO2昏迷小鼠，取肝门静脉中的血液，放置30 min，3 000 r/min 离心，取上层血清，寄送台湾尚捷医事检验所对其中的血糖、总蛋白质、总胆固醇及三酸甘油脂4 项生化指标，以全自动生化分析仪进行检测。

1.4.6 抗发炎试验分组及给药 取健康ICR 小鼠，适应性饲养1 周，测量小鼠耳朵厚度，根据体重S 型分组，分为6 组：空白对照组（Control）、诱发组（TPA 150 μg/mL）、PC 阳性药对照组（吲哚美辛25.0 mg/mL）、青钱柳低L 组（5.0 mg/mL）、青钱柳M 组（12.5 mg/mL）和青钱柳H 组（25.0 mg/mL）。测定小鼠右耳厚度，并将150 μg/mL TPA 20 mL 涂抹于小鼠耳朵，2 h 后重新测定小鼠耳朵厚度，并将对应药物涂抹于相应组别小鼠耳朵，记录0，2，12 h 和24 h 的小鼠耳朵厚度。

1.4.7 数据统计分析 糖尿病鼠体重、血清总蛋白、血糖、三酸甘油脂、总胆固醇均采用（±s，n=5），抗发炎小鼠耳朵厚度采用（±s，n=6）表示，运用SPSS 20.0 统计软件进行统计分析，各指标组间差异采用Duncan 检验，a、b、c、d 表示经Duncan检验加以统计分析后，P＜0.05 时，各组之间具有统计差异。

2 结果与分析

2.1 青钱柳水提物对胰岛RIN-m5F 细胞增殖作用

胰腺内胰岛中央区的β 细胞是胰岛素表达的主要场所。目前2 型糖尿病的发病机制并未完全明确，但众多研究表明，2 型糖尿病的发病原因与胰岛素抵抗和胰岛β 细胞受损有密切关系[7-8]。图1 和表1 研究了青钱柳水提物对大鼠胰岛RINm5F 细胞的增殖作用，可以看出随着青钱柳水提物浓度的提高，对RIN-m5F 细胞的增殖作用逐渐增大，但当青钱柳水提物的质量浓度大于50.0 μg/mL 后，青钱柳水提物对胰腺细胞的增殖作用逐渐减弱，这可能与低剂量兴奋效应有关[9]。低剂量兴奋效应指当机体在受到外来因素的影响时，高剂量发生抑制，低剂量反而产生兴奋效应[10]。

从表1 可以看出，青钱柳水提物对RIN-m5F细胞的增殖作用并不是随着时间的延长而增大的，培养时间为48 h 的OD 值普遍小于24 h，而由1b 图中可以看出，在50.0 μg/mL 质量浓度的青钱柳水提物作用24 h 下，对胰岛RIN-m5F 细胞具有最显著的增殖作用。另外由图1c 可以看出，当青钱柳水提物的质量浓度大于250.0 μg/mL 时，且经过48 h 的培养后，对胰岛RIN-m5F 细胞表现出明显的抑制作用。

表1 青钱柳水提物对胰腺细胞增殖的影响Table 1 The effect of Cyclocarya paliurus extract on proliferation of pancreatic cell

图1 不同浓度青钱柳水提物对胰腺细胞增生率的影响Fig.1 The effect of Cyclocarya paliurus extract concentration on proliferation rate of pancreatic cell

从图2 可以看出，50.0 μg/mL 青钱柳水提物作用组的胰岛RIN-m5F 细胞数量明显大于500 μg/mL 青钱柳水提物组，而500 μg/mL 青钱柳水提物组，与空白对照组数量相当。这也说明了青钱柳水提物在低浓度时有促进胰腺细胞增殖的作用，当水提物达到一定浓度，则会抑制胰腺细胞的生长。

图2 倒置显微镜视野下胰岛RIN-m5F 细胞12 h 生长情况Fig.2 The growth of RIN-m5F cell for 12 h under inverted microscope

2.2 青钱柳水提物降血糖、降血脂功效研究

2.2.1 青钱柳水提物对小鼠体重的影响 在试验期间持续观察各组小鼠的体重变化情况发现，空白组小鼠摄食、饮水及排尿都正常；糖尿病模型组小鼠进食、饮水及排尿量都有明显增加。由表2 中14 d 和21 d 小鼠体重可以看出，青钱柳H 剂量组的体重（33.7，34.7 g）与STZ 组（30.1，31.5 g）有显著性差异（P＜0.05），甚至比糖尿病常用降糖药物格列本脲Gly 组（32.5 g）更接近空白组。这说明青钱柳水提物能促进糖尿病小鼠体重正增长，有减轻糖尿病小鼠消瘦症状的作用。

表2 糖尿病小鼠体重（g）Table 2 The weight of experimental mice（g）

2.2.2 青钱柳水提物对糖尿病小鼠血糖血脂的影响 血糖升高是2 型糖尿病的主要特征之一，其症状表现为持续的血糖升高，并会在一定程度上导致机体代谢紊乱，产生糖毒性[11]。血糖值从侧面反映了胰岛β 细胞的分泌功能[12]。从图3a 中可以看出，STZ 造模组小鼠血糖高达837.8 mg/dL，说明成功诱导了糖尿病小鼠模型，且相对于空白对照组135.8 mg/dL 显著升高，而青钱柳水提物各剂量组血糖值都低于造模组，其中青钱柳水提物M 组效果最显著，血糖值降到506.3 mg/dL，比Gly 组616.0 mg/dL 降血糖效果更好。

糖尿病病人体内利用糖的水平上升，储存糖的水平相对低下，因此会继发蛋白质、甘油三酯等分解代谢加强。由图3b 可看出，STZ 诱发组总蛋白值为4.7 g/dL，其它各剂量组总蛋白的恢复量都与STZ 诱发组达到统计学差异，尤其青钱柳水提物M 组总蛋白最高，为5.4 g/dL，已经超过Gly 组5.0 g/dL，说明一定浓度的青钱柳水提物具有恢复糖尿病小鼠总蛋白含量的作用。

2 型糖尿病是一种具有多种表型的疾病，其特征除了高血糖之外，还伴随着血脂紊乱[13]。图3c和图3d 可以看出，与空白对照组相比，STZ 造模组的TG 和TC 水平显著提高，而青钱柳水提物各剂量组可以明显降低TG 和TC 水平，其中青钱柳水提物M 组的效果最佳。青钱柳水提物M 组的TG 值为152.3 mg/dL，与STZ 造模组200.0 mg/dL具有显著性差异（P＜0.05），且与空白组TG 值143.5 mg/dL 比较接近。图3d 中青钱柳水提物M组的TC 值132.5 mg/dL 与STZ 组170.0 mg/dL 对比，也具有显著性差异，甚至比Gly 组157.8 mg/dL降胆固醇效果更为显著。以上研究结果说明，青钱柳水提物可以改变糖尿病小鼠的血脂紊乱，其中以M 组效果最佳。

图3 不同剂量组小鼠血糖、总蛋白、血脂、胆固醇变化Fig.3 The variation of blood glucose，total protein，triglycerides and cholesterol of different groups

2.3 青钱柳水提物抗发炎试验

2 型糖尿病的主要病理特征是胰岛素抵抗和胰岛β 细胞功能衰竭。随着对2 型糖尿病研究的不断深入，发现炎症反应与β 细胞功能衰竭有关，大量研究表明，炎症因子如白细胞介素类、肿瘤坏死因子α、C 反应蛋白和核因子-kB 等可以通过血液或旁分泌的作用影响胰岛素的敏感性和β 细胞功能，因此，抑制炎症因子能够改善胰岛素抵抗，保护胰岛β 细胞[14-15]。由表3 可以看出，TPA 药物组小鼠耳朵的肿胀度与空白组有显著差异，在作用12 h 后TPA 诱发组与青钱柳各剂量组有显著性差异，并且随着作用时间的延长和青钱柳水提物浓度的增大，抗发炎效果在逐渐增强。与TPA诱发组相比，青钱柳水提物H 组作用12 h 和24 h后，小鼠耳朵的肿胀度分别降低26.9%和27.2%，大于消炎药吲哚美辛（PC 组）。以上研究表明，青钱柳水提物具有很好的抗发炎效果。

表3 青钱柳水提物对小鼠耳朵抗发炎作用效果Table 3 The anti-inflammatory effect of Cyclocarya paliurus extract on the ears of mice

3 结论

2 型糖尿病作为遗传因素和环境因素共同作用而形成的多基因遗传性疾病，是一种复杂的糖代谢疾病，可引起多器官和组织功能失调[16]。随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率逐年升高，糖尿病及其并发症已成为严重威胁人类健康的一种疾病。在生物活性成分的降血糖研究中，以STZ诱导的糖尿病大鼠模型最为常用。STZ 对胰岛β细胞具有高度选择性毒性作用，会促使胰岛β 细胞功能受损、胰岛素合成减少，从而引发糖尿病[17]。然而大剂量注射STZ 易引起对胰岛β 细胞的广泛破坏而形成I 型糖尿病，小剂量多次注射STZ 又不易成功造模。烟酰胺（NA）可以有效清除STZ 产生的NO 及氧自由基，保护部分胰岛β 细胞，从而对STZ 诱导的糖尿病起到预防作用[18]。本研究选用200.0 mg/kg 的NA 预先保护胰岛β 细胞，再给与STZ 破坏，可以成功诱导2 型糖尿病[19-20]。此外，本文为了证实青钱柳水提物在预防糖尿病的效果，采用先给小鼠灌胃青钱柳各剂量组水提物，然后再诱发糖尿病的方式，以期探讨其青钱柳水提物在预防糖尿病中的调节功效。

图4 不同剂量组水提物对小鼠耳朵抗发炎作用效果Fig.4 The anti-inflammatory effect comparison of different groups

糖尿病是以胰岛素抵抗或胰岛β 细胞凋亡为病理基础的代谢性疾病，众多研究表明，2 型糖尿病的发生与胰岛β 细胞受损有密切联系[7]。本研究以大鼠胰岛Rin-m5F 细胞研究青钱柳水提物对胰岛β 细胞的增殖作用，由试验结果可以看出，50.0 μg/mL 青钱柳水提物在作用24 h 时，胰岛β细胞达到最佳增殖率71.0%，这表明青钱柳水提物可以通过保护胰岛，促进胰岛细胞增殖，达到预防糖尿病的作用。Zhao 等[21]研究也发现，青钱柳乙醇提取物可以显著降低活性氧族（ROS）的产生和胰岛细胞凋亡，促进胰岛细胞增殖，缓解STZ 对小鼠胰腺NIT-1 细胞的损伤，降低血糖。Xiao 等[22]对青钱柳叶降血糖的机制进行了研究，发现青钱柳水提物可以通过调节MAPK 和Akt 信号传导通路，从而保护高脂和STZ 诱导的糖尿病小鼠的胰岛细胞，并缓解胰岛β 细胞凋亡。栗静[23-24]运用转录组学探讨了青钱柳提取物预防糖尿病的作用机制，研究发现青钱柳提取物可以上调和胰腺细胞功能存活相关的关键基因的表达，通过保护胰岛，促进胰岛细胞增殖，改善肝脏组织的异常代谢来预防糖尿病。这些与本试验的研究结果基本一致。

脂毒性导致的胰岛素分泌功能障碍是罹患2型糖尿病的重要原因之一。除了高血糖之外，2 型糖尿病还伴随着血脂紊乱，如总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平提高。本文研究结果显示，青钱柳水提物各剂量组可以明显降低STZ 诱导的糖尿病小鼠的血糖、血脂和血胆固醇水平，与STZ 造模组具有显著性差异，表明适当剂量的青钱柳水提物能有效调节脂肪代谢。Liu 等[25]研究表明青钱柳对糖尿病小鼠的降血脂作用与三萜物质有关，三萜的含量与血脂水平呈负相关。

糖尿病的发生与氧化应激有密切关系，在糖尿病的早期、进程及并发症的发生过程中，氧化应激都为重要原因之一[26]。氧化应激的产生会促进促炎介质的产生和释放，而这些促炎介质会引起β 细胞的功能紊乱，从而引发胰岛素抵抗和β 细胞凋亡。本研究表明，青钱柳水提物H 组对青钱柳小鼠耳朵有明显的抗发炎效果，比PC 组消炎药吲哚美辛抗发炎效果更显著。栗静[24]研究也表明，青钱柳提取物可以降低氧化应激水平，降低炎症因子TNF-α 和IL-6 的水平。Liu 等[27]从青钱柳叶中分离出多种具有显著抗发炎活性的达玛烷型三萜皂苷，其中11 种为新的3，4-seco-三萜皂苷，是未来潜在的天然抗炎药物。

综上所述，适当浓度的青钱柳水提物，可以通过抑制炎症、促进胰岛细胞增殖，从而保护胰岛组织，降低血糖，调节脂肪代谢紊乱，以预防糖尿病及其并发症的发生。青钱柳叶作为药食同源的植物，含有多种重要的功能性物质，在预防糖尿病中有显著作用[28]。本研究为青钱柳的精深加工和功能食品的进一步开发提供了重要的理论依据和参考价值。