益生菌Probio-X®对远航海员肠道中乳酸菌菌群的影响

吕瑞瑞，杨成聪，赵飞燕，张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室 呼和浩特010018）

长远航人员长期处于海面-船舱-甲板空间，在远航执勤过程中生活工作环境狭小密闭，生活单调，工作压力大，噪音辐射，海上高温、高湿环境等因素导致远航人员睡眠不足、焦虑甚至抑郁等疾病[1]。长远航人员的生活、饮食及心理状况与陆地工作人员和其他海上作业人员均有所差异[2]。由于长时间脱离陆地，食物补给周期长，以冷冻冷藏食品为主，食品数量及种类受空间限制且贮存时间长，因此易导致营养失衡[3]，易导致心脑血管疾病、胃肠道炎症及免疫系统疾病的发生。Nie 等[4]报道称肠道菌群会受到环境、饮食、遗传因素等方面的影响。

肠道微生物的数量约是人体真核细胞数量的10 倍[5]，被认为是人体虚拟器官，通过基因编码产生多种代谢物，从而参与人体代谢，影响人体表型及健康[6]。肠道菌群随着生存环境、饮食变化及精

收稿日期：2021-01-18

基金项目：国家自然科学基金国际合作交流项目（31720103911）

作者简介：吕瑞瑞（1996—），女，硕士生

通信作者：张和平 E-mail：hepingdd@vip.sina.com神状况而发生改变。Rothschild 等[7]研究发现，饮食、药物和环境因素是影响人体肠道微生物群组成的重要因素，而肠道菌群与心脑血管疾病、胃肠道炎症及神经性疾病的发生均有一定联系。研究表明，抑郁症与个体肠道菌群组成密切相关，肠道菌群通过脑-肠轴影响焦虑、抑郁等行为[8]。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作为肠道中有益微生物，调节肠道环境和维护肠道菌群平衡，一定数量乳酸菌常被认为可反映人体肠道健康状态[9]。益生菌制剂作为新兴的保健食品，可调节人体肠道菌群结构，帮助宿主建立健康的肠黏膜屏障，提高免疫力[10]。本实验室研究人员前期通过宏基因组测序方法分析长远航海员肠道菌群，发现益生菌可维持远航人员肠道菌群稳态[11]，尚未探究远航过程中海员肠道中的乳酸菌是如何变化以及益生菌的摄入是否会对肠道中乳酸菌产生影响。

本研究采用乳酸菌特异性引物与PacBio 三代测序技术相结合的方法，对27 名执行30 d 远洋航海任务的海员进行肠道乳酸菌测序，拟在种水平上揭示长远航海员肠道乳酸菌群落组成及其多样性，并基于肠道特征为其饮食和健康提供参考，以保证该类人群的营养及肠道健康。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 试验志愿者信息及样品采集 参考Zhang等[11]试验设计，仅招募的志愿者人数不同。具体试验设计流程如下：本研究周期30 d，招募27 名长远航海员，随机分为两组，其中复合益生菌组（Probiotics group）11 人，安慰剂组（Placebo group）16 人。本研究用益生菌Probio-XR是由干酪乳杆菌Zhang（Lactobacillus caseiZhang）、动物双歧杆菌V9（Bifidobacterium animalisV9）、植物乳杆菌P-8（Lactobacillus plantarumP-8）、动物双歧杆菌M8（Bifidobacterium animalisM8）和鼠李糖乳杆菌M9（Lactobacillus rhamnosusM9）混合而成，活菌数为1.5×1010CFU/g。复合益生菌组每天服用益生菌Probio-XR2 g，安慰剂组服用口味相同的无菌粉末制剂2 g，持续服用30 d。分别采集出海前（0 d）和出海结束时（30 d）两个时间点的粪便样品。所有志愿者在试验前6 个月及试验期间均未服用抗生素类药物。

1.1.2 主要试剂和仪器 粪便微生物基因组保护液套装（LongseeGEN Stool Storage Kit）、PCR 体系试剂（Taq DNA 聚合酶、dNTP mix、10×Easy Taq Buffer 等），大连宝生物工程有限公司；MOBIO 粪便DNA 快速提取试剂盒，美国MoBio 公司；TBE 缓冲液试剂（Na2EDTA·2H2O、Tris 碱、硼酸）、琼脂糖凝胶，天津基准化学试剂公司；PacBio SMRT 建库试剂盒，美国太平洋生物科学公司。

全自动高压蒸汽灭菌器，日本三洋公司；高速冷冻离心机，德国艾本德公司；微量紫外分光光度计，美国赛默飞科技公司；Applied Biosystems PCR 仪，美国应用生物系统公司；HWS24 型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；Qubit 2.0核酸蛋白定量仪，美国生命技术有限公司；UPV 凝胶成像分析系统，上海赛智创业科学公司；PacBio SMRT RS II 测序平台，美国Pacific Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 粪便样品采集均由海员个人完成，他们均掌握统一粪便采集方法。使用粪便微生物基因组保护液套装，采集约15 g 新鲜粪便样品后，放入-20 ℃冰箱暂存，并尽快运回实验室并存放于-80°C 冰箱，备用。

1.2.2 粪便宏基因组DNA 提取和检测 取0.6 g粪便样品，采用反复冻融法[12]提取样品宏基因组DNA。对提取的DNA 样品用微量紫外分光光度计检测DNA 的纯度和浓度，将符合要求的DNA 样品存于-20°C 冰箱。

1.2.3 乳酸菌目的片段扩增、建库及测序 乳酸菌基因特异性扩增引物[13]如表1所示。在引物两端加一段包含16 个碱基的识别标签（Barcode），用来区分同一文库中的不同样品。用上述引物对已提取的粪便细菌宏基因组DNA 进行扩增。50 μL PCR 反应体系配制：KAPA HiFi HotStart Ready Mix 25 μL；正向、反向引物（10 μmol/L）各1.2 μL；ddH2O 20.6 μL；DNA 模板2 μL。PCR 扩增程序：①预变性98 ℃，3 min；②变性98 ℃，20 s，退火62 ℃，15 s，延伸72 ℃，45 s，26 次循环；③终端延伸72 ℃，90 s，4 ℃终止。按照以上条件进行PCR 扩增，将符合建库条件的PCR 产物混合，按照上机说明书进行后续试验操作，使用PacBio RS II 仪器测序。

表1 乳酸菌特异性引物Table 1 The specific primers of lactic acid bacteria

1.2.4 高质量序列的提取 使用SMRTRPortal条件对原始序列进行质控：①插入片段重复测序的次数≥5；②550 bp≤插入序列长度≤950 bp；③最小预测精确度为90%。质控完成后，根据Barcode 标记序列与样品匹配，删除Barcode 和引物序列进行后续分析。

1.2.5 生物信息学分析 下机数据是基于QIIME平台（V1.75）对质控后序列进行生物信息学分析，分析步骤参考Hou 等[14]的方法。以PyNAST 校准并将序列排齐，在100%相似性下进行Uclust 归并，删除重复序列，按照97%相似性划分操作分类单元（Operational taxonomic unit，OTU），去除嵌合体。分别使用Greengenes（V13.8），RDP（V11.5）和Silva（V128）数据库进行注释。

1.2.6 数据处理 计算香农指数（Shannon Index）和辛普森指数（Simpson Index）从而评估肠道乳酸菌α 多样性。对54 份粪便样品物种丰度表基于Bray-Curtis 距离进行NMDS（non-metric multidimensional scaling,NMDS）分析。利用Venn 图在OTU 水平上分析不同分组间OTU 组成差异。用斯皮尔曼（Spearman）相关系数分析样品中乳酸菌菌种的相关关系并进行显著性检验，检验水平为95%，并使用“gplots”包以热图的形式展现相关性结果。使用“ggplot2”包对QIIME 分析得到的原始数据进行可视化。

1.2.7 核酸序列登记号 将原始数据上传至SRA数据库（PRJNA689416）。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌测序量及多样性

所有样品测序完成后下机得到39 299 条原始序列，经QIIME 质控去除非乳酸菌序列后得到38 819 条高质量序列，用于后续乳酸菌多样性分析。

在此基础上，进一步评估在出海前、后海员肠道乳酸菌多样性以及益生菌对海员肠道乳酸菌的影响（图1）。由图1 可知，安慰剂组和复合益生菌组在出海前、后乳酸菌多样性均为发生显著改变，而复合益生菌组的乳酸菌多样性均有增加的趋势。

图1 α 多样性指数Fig.1 The α diversity index

2.2 乳酸菌菌群组成

乳酸菌作为人体肠道重要的益生菌之一，在健康人体肠道中的相对含量仅占肠道菌群的0.01%～0.18%[15]。准确揭示长远航人员肠道中乳酸菌丰度及多样性有利于评估海员健康和饮食干预。27 名长远航海员肠道菌群在属水平和种水平上乳酸菌组成见图2，其中相对含量<1%属或者种合并为其它属或者种。

在属水平上，共鉴定到57 个属，每个志愿者平均含有（11±4）个属，其中平均相对含量>1%的乳酸菌属有6 个，分别为链球菌属（Streptococcus，55.45%）、乳杆菌属（Lactobacillus，24.75%）、瘤胃球菌属（Ruminococcus，7.15%）、魏斯氏菌属（Weissella，3.22%）、肠球菌属（Enterococcus，3.01%）、乳球菌属（Lactococcus，1.23%）。本文结果与海南健康青年肠道中乳酸菌多样性研究的结果一致[16]。如图2a所示，远航后不同乳酸菌属发生波动，益生菌组中链球菌属在出海后相对含量从63.64%降到43.96%，而安慰剂组中该菌属仅降低1.06%；两组中乳杆菌属相对含量均在出海后增加，益生菌组增加23.00%，安慰剂组增加13.00%，变化均不显著。

图2 远航对肠道乳酸菌组成的影响Fig.2 Effect of long voyage on composition of LAB in intestine

在种水平上，共鉴定到160 个乳酸菌种，每个志愿者平均含有（22±7）个菌种，其中平均相对含量>1%的乳酸菌种有14 个，分别为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，31.05%）、瘤胃乳杆菌（Lactobacillus ruminis，9.31%）、副溶血链球菌（Streptococcus parasanguinis，6.90%）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius，4.11%）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，3.47%）、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum，3.43%）、巴氏链球菌（Streptococcus pasteurianus，2.88%）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa，2.50%）、唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius，2.09%）、伶俐瘤胃球菌（Ruminococcus callidus，1.46%）、粪瘤胃球菌（Ruminococcus faecis，1.42%）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei，1.06%）、耐久肠球菌（Enterococcus durans，1.02%）、罗氏乳杆菌（Lactobacillusrogosae，1.01%）。前期研究结果表明唾液链球菌相对含量最高，未检测到嗜热链球菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌和巴氏链球菌等菌种[16-17]。分析可能是由于海洋与陆地生活、工作环境的差异所致，海上高温、高湿环境以及饮食限制等因素造成肠道中乳酸菌菌群结构的差异。与出海前相比，出海后益生菌组和安慰剂组嗜热链球菌的相对含量均下降10.00%；与出海前相比，出海后益生菌组的副血链球菌相对含量约下降2.00%，而安慰剂组的相对含量升高8.00%；海员出海后植物乳杆菌和发酵乳杆菌相对含量均升高，益生菌组增加10.00%，安慰剂组仅增加4.00%；益生菌组的巴氏链球菌相对含量提高5.00%，而安慰剂组在出海后基本无变化。

2.3 乳酸菌群落结构分析

Venn 图常用于反映样品间共有和独有物种情况。本研究在OTU 水平，通过Venn 图对各组样品肠道乳酸菌进行比较分析，结果显示（图3）各组之间乳酸菌差异比较明显。在OTU 水平上，在4个分组共发现1 348 个OTU，其中各分组特有OTU 数量各不同，益生菌组（0 d）有175 个，益生菌组（30 d）有353 个，安慰剂组（0 d）有384 个，安慰剂组（30 d）有498 个，核心OTU 为5 个。结果显示远航后益生菌组和安慰剂组特有OTU 均增加，与吕伟[2]采用二代测序方式对海员肠道菌群的分析结果一致，这可能是因受海洋环境影响，出海后海员肠道菌群中水源性微生物数量和含量增加。

图3 OTU 水平下不同分组中乳酸菌韦恩图Fig.3 Venn diagram of lactic acid bacteria in different groups at OTU level

肠道菌群结构对于维持宿主机体平衡以及健康具有重要意义[18]。无度量多维标定法（Nonmetric multi-dimensional scaling,NMDS），适用于生态学研究的排列方法，反映组内或组间样本差异。本研究对所有样品中乳酸菌相对含量进行NMDS 分析（图4）。图4 中各样本点分布并无显著聚类趋势，表明4 组粪便样品中乳酸菌结构变化有限。益生菌组和安慰剂组各组内样本也没有显著聚类现象，这可能是因为人体肠道菌群具有自身调节功能，在不同环境下可进行稳态调整。吕伟[2]前期研究发现，远航后海员肠道菌群虽会发生变化，但并不会过度紊乱，亦或因远航海员长期共同生活在船舱，故菌群之间发生交换。前期研究发现同居人群肠道微生物群落会随时间变化发生聚集性变化，且肠道菌群生态系统具有一定的个体适应力[19]。

图4 基于乳酸菌菌种相对含量的NMDS 分析Fig.4 NMDS analysis based on relative abundance of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌菌群相关性分析及益生菌对肠道乳酸菌的影响

肠道微生物通过相互作用维持人类肠道健康及稳态，可代谢营养物质产生细菌素、乳酸和其它代谢物，促进有益菌的繁殖并抑制有害菌生长，保持肠道菌群处于相对平衡的状态[20]。为揭示人体肠道乳酸菌之间的关系，选取相对含量大于1%的物种进行Spearman 相关性分析（图5）。结果显示，嗜热链球菌和副血链球菌、唾液链球菌呈显著正相关（r=0.33，r=0.71），与发酵乳杆菌、瘤胃乳杆菌呈显著负相关（r=-0.34，r=-0.45）；瘤胃乳杆菌和副血链球菌、唾液链球菌、罗氏乳杆菌呈显著负相关（r=-0.45，r=-0.37，r=-0.28）；副血链球菌和唾液链球菌呈显著正相关（r=0.61）；植物乳杆菌和发酵乳杆菌呈显著正相关（r=0.30）；副血链球菌和伶俐瘤胃球菌呈显著负相关（r=0.28）；粪便瘤胃球菌和罗氏乳杆菌呈显著正相关（r=0.48）。

图5 肠道中乳酸菌的相关性Fig.5 Spearman's rank correlation of LAB in the gut

为进一步探究益生菌的摄入在物种水平上对肠道乳酸菌的影响，本文采用Wilcox 检验揭示乳酸菌菌种差异（图6）。由图6 可知，远航前，益生菌组和安慰剂组的副血链球菌（Streptococcus parasanguinis）并无显著差异，远航后，安慰剂组中该菌相对含量显著高于益生菌组（P<0.05）；血链球菌（Streptococcus sanguinis）相对含量在益生菌组（30 d）显著减少（P<0.05），但安慰剂组30 d 时该菌并未发生显著变化。有研究报道副血链球菌是导致牙菌斑（dental plaque）形成的早期微生物之一，且当该菌侵入血流，可引起伺机性之心内膜炎感染[21]。血链球菌属于条件致病菌，常定植于口腔、鼻咽部及消化道等部位，血链球菌不仅可导致

图6 远航后具有显著差异的乳酸菌菌种（P<0.05）Fig.6 LAB strains with significant differences after long-voyage（P<0.05）

心内膜炎，还可诱发动脉粥样硬化[22-23]。在远航过程中摄入益生菌Probio-FitR显著抑制海员肠道中副血链球菌和血链球菌增殖，在一定程度上维护了海员肠道健康。Turroni 等[24]发现益生菌进入宿主可通过刺激自身免疫，从而促进肠道微生物平衡，维持宿主健康。

2.5 远洋航行后海员肠型的变化

Arumugam 等[25]提出肠型的概念，目前已知有以拟杆菌属（Bacteroides）、普氏菌属（Prevotella）和瘤胃球菌属（Ruminococcus）为优势菌属的3 种肠型。本研究基于多维聚类分析和PCoA，分析远航前、后益生菌组和安慰剂组海员肠道中优势乳酸菌肠型簇，结果显示（图7），海员肠道菌群主要分为4 种肠型，肠型优势乳酸菌分别为唾液乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液链球菌和嗜热链球菌，每类肠型以1 个或2 个优势乳酸菌组成。部分海员最初肠道以唾液链球菌和嗜热链球菌或仅嗜热链球菌为特征，在远航后转变以植物乳杆菌、发酵乳杆菌或唾液乳杆菌为优势菌的乳酸菌肠型。另一部分海员乳酸菌肠型簇未发生变化。为探究出现这一现象的原因，将出海前海员分为肠型变化组（C 组）和肠型未变组（U 组），作者发现U 组海员原始乳酸菌菌群中的Streptococcus sinensis和副血链球菌显著高于C 组（P<0.05），特别是副血链球菌在C 组中平均相对含量为7.23%，在U组仅为2.16%，而副血链球菌和嗜热链球菌、唾液链球菌为显著正相关，故认为副血链球菌促进以链球菌属为主的两类乳酸菌肠型的稳定。C 组中乳酸菌肠型发生改变的原因可能是部分海员自身肠道中嗜热链球菌和唾液链球菌相对含量较少，且益生菌组海员摄入包含植物乳杆菌 P-8 的益生菌制剂，植物乳杆菌和发酵乳杆菌呈正相关，因前者的良好的定殖能力[11]，促进后者增殖，最终使该类海员乳酸菌肠型发生改变。研究发现发酵乳杆菌能调节天然免疫与适应性免疫，具有抗炎症作用[26]。益生菌Probio-X®促进肠道乳酸菌组成发生了更有利的改变，有益菌的数量增多，先前的研究表明因个体间的差异可能导致摄入后益生菌的反应不同，益生菌Probio-X®对肠道乳酸菌组成产生个人特异性影响[27]。然而本研究样本量较小，仍有待研究。综上所述，食用益生菌Probio-X®在一定程度上改变了海员乳酸菌肠型，而这种改变取决于肠道原始乳酸菌的类别和基础数量。

图7 长远航对海员肠道乳酸菌菌群特征的影响Fig.7 The effect of long-voyage on the characteristics of Lactobacillus enterotype-like cluster in seafarers

3 结论

本研究采用乳酸菌特异性引物和第3 代测序技术相结合，对27 名长远航海员肠道中乳酸菌丰度及其多样性进行检测，共鉴定到57 个属和160个菌种。远航后海员肠道中乳酸菌多样性增加，复合益生菌组和安慰剂组肠道乳酸菌结构虽无显著差异，而在物种水平上，益生菌干预可显著抑制长远航海员肠道中副血链球菌和血链球菌的增长。摄入益生菌使部分海员乳酸菌肠型中优势菌由链球菌属变为乳杆菌属，而这种改变取决于肠道原始乳酸菌的类别和基础数量。