Percoll分离法联合MALDI-TOF MS直接鉴定血培养专性厌氧菌阳性标本的应用价值*

梁 林，幸 雯，张 京，陆必超，丁秀荣，刘志忠△

1.首都医科大学康复医学院，北京 100069；2.中国康复研究中心北京博爱医院检验科，北京 100068;3.首都医科大学附属北京佑安医院检验科，北京 100069

厌氧菌广泛分布于人体皮肤及各种腔道的深部黏膜表面，在机体免疫力受损、深部组织损伤或者需氧菌感染等情况下，会诱发感染。厌氧菌所致的血流感染约占临床血流感染的1%～17%，并且具有较高的致死率[1-2]。对厌氧菌及时准确的鉴定对优化抗菌药物治疗、改善患者预后至关重要，但传统的厌氧菌鉴定方法所需时间至少为48 h，严重阻碍了临床对感染的控制和治疗。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年发展起来的一种细菌鉴定技术，不仅可对纯培养的菌落进行鉴定，还可对培养呈阳性的血液、尿液等体液标本进行直接鉴定，明显缩短了鉴定时间。但目前，应用MALDI-TOF MS对血培养阳性标本进行直接检测的文献主要涉及各种需氧菌、兼性厌氧菌和真菌的检测[3-6]，很少涉及专性厌氧菌的检测[1-2,7]。本实验室采用细胞分离液(Percoll液)密度梯度离心的方法(简称Percoll分离法)分离、富集专性厌氧菌用于MALDI-TOF MS的直接检测，并与十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤法进行比较分析，旨在对两种不同前处理方法的鉴定准确率进行比较。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料来源 收集2018年3月至2020年9月中国康复研究中心北京博爱医院和首都医科大学附属北京佑安医院血培养单独厌氧瓶阳性的标本。同一患者送检多套标本则只选择最早报阳的厌氧瓶。本研究仅汇总了经鉴定为专性厌氧菌的检测结果。

1.1.2仪器与试剂 MicroflexTMMALDI-TOF MS仪和Biotyper 3.1鉴定分析软件、基质液、甲酸、96孔金属靶板均购自德国Bruker Daltonik公司；BACTECTM FX血培养仪及配套培养瓶购自美国BD公司；0.05%SDS溶液购自美国Sigma公司；Percoll细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2方法

1.2.1菌种鉴定 血培养标本培养报阳后立即取出厌氧菌培养瓶，染色镜检，同时进行MALDI-TOF MS直接检测和传统的培养鉴定流程。

1.2.2Percoll分离法 在王瑞霞等[8]方法的基础上进行了相应的改进。抽取3 mL培养瓶内容物和3 mL生理盐水移入15 mL离心管混匀，1 000 r/min离心10 min，移上清液(含待测菌)至另一离心管内，5 000 r/min，离心5 min，弃上清液，加超纯水0.4 mL，转移到5 mL离心管中(事先加入2 mL Percoll液，体积比Percoll∶NaCl=3∶7)，5 000 r/min离心5 min，弃去上清液，余下液体转移至2 mL平底 EP管，13 000 r/min离心2 min，弃上清液，超纯水重复洗涤2次至清亮。

1.2.3SDS洗涤法 在MENGLAN等[3]方法的基础上进行了一定的修改。抽取3 mL培养瓶内容物和3 mL生理盐水移入15 mL离心管混匀，1 000 r/min离心10 min，移上清液(含待测菌)至另一离心管内，加入1 mL 0.05% SDS溶液，颠倒混匀，5 000 r/min，离心5 min，弃上清液，加超纯水1.5 mL混匀后移至2 mL平底 EP管，13 000 r/min离心2 min，弃上清液，重复洗涤2次，尽量排干多余水分。

1.2.4直接鉴定 吸取1 μL富集的菌体涂布于96孔金属靶板上，室温干燥；加入70%甲酸1 μL，室温干燥；加基质液1 μL覆盖，室温干燥，将靶板放到MALDI-TOF MS质谱仪上，应用Biotyper 3.1鉴定分析软件进行鉴定，记录鉴定结果和分值。

1.2.5传统培养鉴定 将报阳标本转种至血琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，厌氧环境，35 ℃孵育24～48 h。获得纯菌落后，用MALDI-TOF MS进行鉴定。分值量化判定结果：评分≥2.0鉴定到“种”；1.7≤评分<2.0鉴定到“属”；评分<1.7则未鉴定出。

1.3统计学处理 使用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料以频数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1患者一般资料和菌株传统鉴定方法结果 研究期间共有578瓶血培养厌氧瓶阳性，经鉴定其中81瓶为单一菌种的专性厌氧菌，由于9份标本所得纯菌落不能被仪器准确鉴定而被舍弃，最终共有71份标本纳入了研究，其中50份来自首都医科大学附属北京佑安医院，21份来自中国康复研究中心北京博爱医院。菌株来源的患者中男51例(71.8%)，女20例(28.2%)；年龄5～82岁，平均(55.7±15.3)岁。患者原发病依次为乙型肝炎肝硬化16例(22.5%)，肝癌14例(19.7%)，其他系统肿瘤11例(15.5%)，酒精性肝硬化6例(8.5%)，丙型肝炎肝硬化5例(7.0%)，肝脓肿5例(7.0%)，原发性胆汁性肝硬化3例(4.2%)，胰腺炎2例(2.8%)，高位截瘫2例(2.8%)，产后感染2例(2.8%)，其他5例(7.0%)。71株菌株中革兰阴性菌30株(42.3%)，包括阴性杆菌26株，阴性球菌4株；革兰阳性菌41株(57.7%)，包括阳性杆菌30株，阳性球菌11株。

2.2经Percoll分离法和SDS洗涤法处理后标本MALDI-TOF MS鉴定结果的比较 使用Percoll分离法处理标本，“种”水平鉴定准确率为84.5%，其中革兰阴性菌的“种”水平鉴定准确率为80.0%，革兰阳性菌的“种”水平鉴定准确率为87.8%。使用SDS洗涤法处理标本，“种”水平鉴定准确率为60.6%，其中革兰阴性菌的“种”水平鉴定准确率为46.7%，革兰阳性菌的“种”水平鉴定准确率为70.7%。见表1。

表1 经Percoll分离法和SDS洗涤法处理后标本MALDI-TOF MS鉴定结果的比较[n(%)]

2.3经Percoll分离法和SDS洗涤法处理后标本MALDI-TOF MS鉴定各类病原菌结果比较 与SDS洗涤法相比，采用Percoll分离法处理标本后MALDI-TOF MS对革兰阴性杆菌的鉴定准确率明显增加(80.0%vs.46.7%,χ2=7.177,P=0.007)，特别是脆弱拟杆菌“种”水平鉴定准确率由45.5%提高到100.0%。但两种处理方法对普雷沃菌“属”水平的细菌鉴定准确率均不高。见表2。

表2 经Percoll分离法和SDS洗涤法处理后标本MALDI-TOF MS鉴定各类病原菌结果比较[n或n(%)]

续表2 经Percoll分离法和SDS洗涤法处理后标本MALDI-TOF MS鉴定各类病原菌结果比较[n或n(%)]

3 讨 论

专性厌氧菌对培养及鉴定条件的要求十分苛刻[9]。传统的生化鉴定技术因受多种因素的影响在厌氧菌的鉴定中鉴定率较低，鉴定周期较长，不能满足临床的要求[10-11]。MALDI-TOF MS是近年来新兴的微生物鉴定技术，能快速、准确地鉴定多种临床常见的血培养专性厌氧菌。MALDI-TOF MS用于血培养厌氧菌阳性标本的直接鉴定也有相关文献报道[1-2,7]。

影响MALDI-TOF MS直接鉴定准确率的关键因素是血培养瓶的种类和对菌液的预处理方法。与需氧培养瓶不同，临床常用的厌氧瓶含有溶血素，能充分破坏血细胞，可减少血细胞对直接鉴定的影响。ALMUHAYAWI等[2]用去离子水直接洗涤血培养阳性标本用于MALDI-TOF MS的厌氧菌鉴定，但由于培养瓶中其他干扰物质的存在，其“属”水平鉴定准确率仅为76%左右。而采用目前常用于需氧瓶预处理的方法如Sepsityper试剂盒、分离胶促凝管、皂素溶解、滤膜吸附和SDS洗涤等方法来处理厌氧菌标本其鉴定准确率明显低于需氧菌。JEVERICA等[1]采用Sepsityper试剂盒直接鉴定厌氧菌，其鉴定准确率仅为56.3%，采用皂素溶解洗涤法则其鉴定准确率为84.9%。王军杰等[12]采用分离胶促凝管法，对厌氧菌的鉴定准确率为66.7%，明显低于对需氧瓶中细菌的鉴定准确率。国外的研究者更倾向于采用SDS洗涤法来处理血培养阳性标本用于MALDI-TOF MS的直接鉴定[13]。SDS是一种温和去污剂，能够辅助纯化菌体，去除干扰因素，提高直接鉴定细菌的准确率[13]。有研究发现，采用SDS洗涤法处理血培养阳性标本用于鉴定厌氧瓶中细菌，其准确率明显高于分离胶促凝管法[6,14]。本研究采用SDS洗涤法处理的标本用于MALDI-TOF MS直接检测，其鉴定准确率仅为62.5%。而且，在研究过程中笔者发现，尽管使用了较低浓度(0.05%)的SDS溶液来处理标本，SDS仍会对部分革兰阴性菌的形态产生影响，特别是脆弱拟杆菌在SDS的作用下会出现“黏液化”现象，从而聚集成团，严重影响细菌鉴定的准确性。周春妹等[5]也发现，在使用SDS溶液洗涤后革兰阴性菌的鉴定准确率由92.3%下降至85.3%。这可能与细菌的细胞壁结构差异有关，与革兰阳性菌相比，革兰阴性菌的细胞壁更薄，并含有较多的脂类和蛋白，可能更容易被SDS所破坏。

Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，不穿透生物膜，对细胞无毒害作用，常用于实验室中细胞、细菌和病毒的分离[8,15]。本研究采用Percoll∶NaCl=3∶7的比例配制的Percoll液来分离、纯化厌氧菌用于MALDI-TOF MS的直接鉴定，鉴定准确率为84.7%，明显高于SDS洗涤法，且高于JEVERICA等[1]Sepsityper试剂盒法结果，但与该研究的皂素溶解洗涤法结果相近。而在本研究脆弱拟杆菌的鉴定中，采用Percoll分离法时，其鉴定准确率更是由SDS洗涤法的45.5%提高到100.0%。但与SDS洗涤法相比，Percoll分离法要增加洗涤过程，相对增加了实验的繁复性，而且在洗涤过程中会造成部分菌体的丢失，使最终获得的菌量少于SDS洗涤法。

综上所述，采用Percoll分离法联合MALDI-TOF MS直接鉴定血培养专性厌氧阳性标本，具有操作简单、结果准确、缩短鉴定结果报告周期等优势，特别是Percoll分离法对提高MALDI-TOF MS 在革兰阴性厌氧菌的鉴定准确率中有较大帮助，值得在临床微生物实验室推广。