细胞膜电位对大鼠BMMSCs基本生物学行为影响的研究

李沛汉 郎凯 刘婧 蒙萌 宋文

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)是组织工程领域研究最为经典的种子细胞，具有体外扩增、多向分化等潜能，被广泛地应用于各种组织再生的研究[1]。多种因素均可影响BMMSCs的细胞学行为，主要有物理因素、化学刺激以及生物因子刺激等，例如特定的纳米形貌[2]、Sr离子[3]、BMP因子[4]等刺激均可诱导BMMSCs向成骨方向分化，这些特点为利用BMMSCs促进骨组织再生的研究提供了重要策略。细胞膜电位是细胞最基础的电生理参数之一，最初在可兴奋细胞神经元、心肌细胞等被完整阐释，其基本概念为细胞膜上的Na+-K+泵持续维持了细胞内高K+浓度和细胞外高Na+浓度，为对抗离子浓度梯度的化学扩散趋势，细胞形成一个跨膜的负电位，使得电力作用与化学浓度梯度相平衡。随着研究的深入，膜电位在许多不可兴奋细胞中的作用也逐渐受到重视，其中就包括了BMMSCs[5]。已有研究证实人BMMSCs在分化过程中膜电位差增加，在去极化或超极化处理后分别会抑制/促进其分化[6-7]。然而目前国内尚缺乏针对膜电位对BMMSCs行为影响的系统性研究，且其调控机制尚不明确。本实验观察了去极化和超极化对BMMSCs迁移、增殖以及分化的影响，分析了胞浆钙离子浓度的变化，初步证实了膜电位在BMMSCs基本生物学行为中有重要作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料

SD大鼠(第四军医大学动物中心)；α-MEM、胎牛血清、双抗、含EDTA胰蛋白酶、PBS、HBSS(Hyclone，美国)；CCK8、DiSBAC、Fluo-8 AM胞浆钙离子染色试剂盒(Invitrogen，美国)；抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、地塞米松(西安沃尔森)；乌本苷(ouabain)、二氮嗪(diazoxide)、茜素红、氯化十六烷基吡啶(Sigma-Aldrich，美国)。

1.2 细胞分离培养

采用全骨髓贴壁法进行大鼠BMMSCs的分离培养。选择约1 周龄的雄性SD大鼠，脱颈处死后在75%酒精中浸泡15 min消毒；在超净工作台内PBS浸润下进行四肢长骨的分离，剪开两端后用注射器吸取α-MEM冲洗骨髓腔，收集全部产物进行离心，将沉淀物用α-MEM+20%胎牛血清+0.1%双抗进行贴壁培养。约5 d后进行初次换液，待细胞密度至～80%行胰蛋白酶消化传代，培养液血清降低至10%；约3～5代后细胞纯度较好，进行后续实验观察。

1.3 细胞膜电位染色

依据前期文献报道采用电压敏感性染料DiSBAC对膜电位进行半定量分析[6]。将细胞按2 万/孔密度接种到24 孔板内，在常规培养液内增值3 d，随后换成成骨诱导液诱导3 d，即在常规培养液基础上再加入抗坏血酸(50 μg/ml)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)和地塞米松(100 nmol/L)。在连续6 d内监测细胞膜电位的变化，即在HBSS中稀释DiSBAC母液至工作浓度，与活细胞在37 ℃孵育5 min后直接进行荧光显微镜拍照，固定曝光时间在77 ms，对拍摄的照片采用Image J软件进行荧光强度分析。

1.4 划痕试验

采用划痕试验进行细胞迁移的观察。将细胞按4 万/孔密度接种在24 孔板内适应24 h后使细胞达到合适密度，采用1 mL枪头在板底纵横两个方向划出宽度约5 mm的十字交叉无细胞区域，立刻进行显微镜拍照。分别在培养液中不同物质确定试验分组：无添加为空白组、添加乌本苷(ouabain，10 nmol/L)为去极化组、添加二氮嗪(diazoxide,10 μmol/L)为超极化组。继续培养24 h后再次进行显微镜拍照。

1.5 细胞增殖

细胞接种培养及分组同“1.4”。在处理24 h后将培养液换成CCK8工作液(常规培养基稀释后的CCK8母液)，37 ℃继续孵育3 h后取出，小心吸取上清液转移至96 孔板中在450 nm处检测吸光度。

1.6 茜素红染色

细胞接种培养同“1.4”，在进行成骨诱导时在成骨诱导液内分别添加不同物质确定试验分组：无添加为空白组、添加乌本苷(10 nmol/L)为去极化组、添加二氮嗪(10 μmol/L)为超极化组。持续诱导21 d后将细胞固定在4%多聚甲醛中，室温行茜素红染色10 min，去离子水漂洗后显微镜拍照；随后将染色用氯化十六烷基吡啶溶解，于580 nm处测定吸光度进行染色半定量分析。

1.7 胞浆钙离子染色

细胞接种与培养及分组同“1.4”，密度减为2 万/孔，处理24 h后将细胞孵育在含Fluo-8 AM(5 μmol/L)与Pluronic F-127(0.02%)的混合工作液α-MEM中，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗后荧光显微镜拍照。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 细胞增殖分化过程中膜电位变化

采用电压依赖性染料染色可展现出细胞跨膜电位的变化，细胞在常规培养基中连续增殖3 d，换成成骨诱导液分化3 d，采用电压敏感性染料DiSBAC染色进行荧光显微镜拍照,在细胞增殖阶段可见细胞数量显著增加，但平均细胞的荧光强度未见显著差异，提示膜电位变化不大；而当换成成骨诱导液后，细胞荧光强度急剧增加，并逐渐维持在较高水平，表明细胞在成骨分化过程中细胞跨膜电位显著增加，发生了超极化现象(图 1)；半定量分析可见在增殖阶段膜电位变化不显著，添加成骨诱导液荧光强度增强40 倍以上(图 2)。

2.2 细胞膜电位对细胞迁移的影响

划痕试验评估BMMSCs的迁移速率可见，未处理状态下经历24 h细胞划痕部分得到修复，在去极化处理后划痕愈合显著增加，而在超极化处理后仅可见散在的细胞分布在划痕区域内(图 3)；半定量分析可见在细胞去极化处理后迁移速率增加约1 倍，当细胞超极化处理时，迁移速率下降约1 半(图 4)。

图 2 相对细胞平均荧光强度

2.3 细胞膜电位对细胞增殖的影响

采用CCK8测试分析不同处理后细胞活力变化，可见在细胞去极化处理后增殖活性显著增加约3 倍，而在超极化处理后细胞增殖活力受到显著抑制一半以上(图 5)。

2.4 细胞膜电位对细胞成骨分化的影响

通过茜素红染色分析细胞成骨分化能力可见与未处理组细胞相比，细胞去极化处理后钙结节形成有所减少，而在超极化处理后钙结节染色则显著增多；半定量分析可见在去极化处理后细胞分化收到显著抑制，与之相反，去极化处理后分化能力提升了1 倍以上(图 6)。

图 3 划痕试验

图 4 细胞迁移速率 图 5 细胞增殖

2.5 胞浆钙离子浓度变化

胞浆钙离子浓度变化是与细胞膜电位变化最为相关的因素之一，通过胞浆钙离子染色观察,去极化处理后较未处理组胞浆荧光强度显著增加，而超极化处理后则显著降低；半定量分析可见去极化处理后胞浆钙离子浓度上调约4 倍，而超极化则下降达一半以上(图 7)。

图 6 成骨分化(茜素红染色)

图 6 胞浆钙离子检测

3 讨 论

细胞电生理活动是最基础的特征之一，越来越多的研究证实，除了神经元等可兴奋细胞外，不可兴奋细胞的电生理特性也参与了细胞多种重要的生理活动。BMMSCs是组织工程中极为重要的种子细胞来源，其电生理行为也受到了一定关注，然而目前仍未有广泛的研究探索，可能是一个被忽略的重要调控环节。

本研究发现在早期的增殖过程中BMMSCs的跨膜电位未发生显著变化，这与前期报道的肿瘤细胞或细菌在增殖中会发生的电位变化不一致[8-9]，且Bhavsar等[10]在大鼠BMMSCs中也观测到了增殖对应的特征性膜电位变化，并提出了其潜在的调控意义。这一方面可能是观测时间跨度不足，另一方面可能BMMSCs的膜电位与培养液中的成分关系十分密切，因为一旦换成成骨诱导液后跨膜电位发生急剧性的增加，此后一直保持在较高的水平，表明成骨诱导液中的成分可能引起了细胞膜离子通道的大幅度变化。

随后研究发现采用乌本苷对BMMSCs去极化处理后细胞迁移速率和增殖活性显著增强；与之相反，采用二氮嗪诱导细胞超极化反应后细胞迁移速率和增殖能力受到显著抑制，即去极化可激活细胞增殖信号，促进细胞的增殖和迁移行为，而超极化则与之相反，这与已有的相关报道相一致。例如在肿瘤细胞的研究中证实，跨膜电位是控制肿瘤细胞生长增殖的重要参数之一，一方面在诱导肿瘤形成过程中细胞膜电位表现为去极化特征，另一方面在诱导细胞超极化后可显著抑制肿瘤形成[8]；在人BMMSCs的观测中也证实，增殖与K+的含量变化关系密切，而K+则是维系膜电位的基础[11]。在诱导BMMSCs发生去极化或超极化后可分别抑制和促进其成骨分化能力，与前期的文献报道结论一致[6]，这提示细胞膜电位可能作为一种全新的干预靶点实现对BMMSCs成骨分化的调控，对诱导骨组织工程再生提供了新思路。

然而目前对于BMMSCs的电生理活动研究尚未有广泛开展，膜电位对于其行为的调控机理尚不完全明确。可推测钙离子可能是膜电位变化调控细胞行为的关键桥梁，一方面钙离子的平衡与细胞电生理活动密切相关[12]，本研究也发现在细胞发生去极化或超极化后，相应胞浆钙离子浓度显著上升或下降；另一方面，钙离子信号介导了细胞迁移、分化等多种生理活动[13]。然而也有研究认为钙离子信号是膜电位调控细胞行为中的次要方面，发挥最关键作用的是磷酸根离子信号或者与膜电位直接联系的钾离子浓度变化引起的细胞行为改变[11,14]。无论如何，这方面的研究还十分欠缺，有待于更进一步的深入探索。

4 结 论

本研究发现BMMSCs的膜电位对细胞行为具有重要的调控意义，即诱导BMMSCs发生去极化后细胞的迁移和增殖能力显著增强，而成骨分化能力受到抑制；反之，诱导细胞超极化后其迁移、增殖能力显著抑制，而成骨分化能力显著提升。这种调控现象可能与膜电位诱导的胞浆钙离子浓度变化有关，更进一步的调控机理尚有待分析。这些发现为组织工程领域诱导BMMSCs特定生物学功能提供了全新的干预方向。