甲状腺激素受体β基因对β淀粉样蛋白42诱导的小胶质细胞炎症和细胞凋亡作用机制

康 涛,朱利娟,曹冰清,薛延莉,杨 谦

(1.陕西省人民医院神经内科，陕西 西安710068；2陕西省人民医院麻醉科，陕西 西安710068)

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病[1]。临床上AD的特点是大量的淀粉样蛋白刺激神经元和突触，诱发神经炎症，最终导致记忆丧失。β淀粉样蛋白(Amyloid-β，Aβ)在大脑中的大量积累被认为是AD发展的重要标志，Aβ沉积在AD的发病机制中起着决定性的作用[2]，靶向Aβ斑块的示踪剂已被用于影像学临床应用及研究[3]。

甲状腺激素受体β基因(Thrb)对神经发育起着重要的调控作用。同时，Thrb在听觉和视觉功能中起着重要作用，是影响脊椎动物神经系统发育的关键介质[4]。目前，关于Thrb对AD作用的研究报道较少，因此有必要对其在AD中的作用及作用机制进行进一步探究。

Sirt3(Sirtuin 3)是哺乳动物Sirtuin家族的成员，是一种依赖于NAD的组蛋白去乙酰化酶，主要存在于线粒体中[5-6]。有报道称，Sirt3通过调节靶蛋白(包括能量代谢介质和线粒体氧化还原应激蛋白)调节线粒体内稳态[7]。近年来，人们发现Sirt3在Aβ诱导的AD中起着重要作用[8]。Salvatori等[9]报道称，Sirt3的降低与AD患者的线粒体功能障碍有关，Sirt3的表达随着AD的进展而降低。本试验旨在探究Thrb对Aβ42诱导的小胶质细胞氧化应激和凋亡的作用以及作用机制，从而为临床上老年痴呆症的治疗提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小胶质细胞BV2购自中国科学院昆明动物研究所；RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国HyClone公司；Trizol、反转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative Real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)试剂盒购自美国Promega公司；BCA蛋白质定量检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠Thrb、兔抗鼠caspase-3、兔抗鼠caspase-9、兔抗鼠Sirt3、兔抗鼠FOX3a和鼠抗GAPDH购自美国Abcam公司；转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司；PCR引物、pcDNA3.1-Thrb、si-Sirt3和si-FOX3a由北京擎科生物科技有限公司设计、合成；二氧化碳培养箱购自上海力申科学仪器有限公司；PCR仪和iMark酶标仪购自美国BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：小胶质细胞BV2用含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 细胞转染：pcDNA3.1-Thrb以及si-Sirt3和si-FOX3均由北京擎科生物科技有限公司设计、合成。根据Thrb的序列，设计合成PCR引物，扩增Thrb基因全长，连接于线性化的过表达载体pcDNA3.1(+)上，形成可表达Thrb的同源重组质粒(pcDNA3.1-Thrb)。将细胞分为未处理组(Untreated)、空白对照组(Control)、阴性对照组(pcDNA3.1)、Thrb过表达组(pcDNA3.1-Thrb)及si-Sirt3和si-FOX3a。按照Lipofectamine 3000®说明书将pcDNA3.1-Thrb及si-Sirt3和si-FOX3a按照以上分组转染至BV2细胞中，置于37 ℃、5% CO2条件下继续培养。孵育48 h后检测转染效率，实验设置3个重复。

1.2.3 细胞增殖:将BV2细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h；向培养板中加入不同浓度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)的WST-8，于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养24 h；每孔加入20 μl CCK溶液，孵育24 h；酶标仪测定450 nm处的OD值。

1.2.4 细胞凋亡率的测定:对于细胞凋亡检测，收获转染pcDNA3.1-Thrb和对照质粒pcDNA3.1 48 h后的细胞，离心，并重悬于结合缓冲液中。然后，异硫氰酸荧光素(FITC)和PE-Texas Red溶液连续染色细胞，使用FACSCalibur TM流式细胞仪进行分析。

1.2.5 炎症因子的测定:按照相应的ELISA试剂盒说明检测BV2细胞中的一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的浓度。具体操作如下：准备试剂、样品；加入准备好的样品，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入酶标试剂，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入显色液A、B，37 ℃显色10 min；加入终止液，读OD值。

1.2.6 活性氧(ROS)的测定：将BV2细胞以1×105个/孔的密度接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；收集细胞，在37 ℃下用活性氧指示剂DCFH-DA(10 μmd/L)在PBS中培养30 min。使用流式细胞仪(BD Biosciences，CA)分析荧光。

1.2.7 RT-PCR:将BV2细胞以1×105个/孔的密度接种于12孔板，培养24 h后吸去上清液，收集细胞， Trizol法提取胃癌细胞株总RNA，进行反转录合成cDNA。qRT-PCR检测Thrb基因的mRNA表达。引物序列如下，Thrb正向序列：5’-ACGTAACGCTACTGGGACGTT-3’，反向序列：5’-AGTTAGGACGTATACGACAGG-3’；β-actin正向序列：5’-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3’，反向序列：5’-AGGAATCCTTCTGACCACTGC-3’。以2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。β-actin为内参。

1.2.8 Western blot:消化对数生长期的BV2细胞，接种于25 cm2培养瓶中，细胞融合至80%～90%时进行细胞转染。48 h后收集各组细胞，收集细胞上清液，并消化下贴壁细胞，加RIPA裂解液于冰上裂解10 min，4 ℃、12000 r/min离心30 min(离心半径9.5 cm)。上清液用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定蛋白含量后，取30 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，130 V恒压电泳2 h；湿转法将蛋白转移至PVDF膜上；室温下以含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液粉笔PVDF膜1 h，裁剪后分别与一抗孵育，4 ℃过夜；TBST清洗膜8 min，重复4次，加相应的HRP标记的二抗，室温孵育2 h；TBST重复清洗膜4次，ECL试剂盒检测蛋白表达，以GAPDH作为内参。

2 结 果

2.1 Aβ42显著抑制Thrb表达且具有剂量依赖性 RT-PCR和Western blot检测BV2细胞经不同浓度(50、100 ng/ml)的Aβ42诱导后Thrb的表达量。结果显示，BV2经Aβ42诱导后Thrb的mRNA和蛋白的表达量均显著降低，且呈剂量依赖性(均P<0.05，图1A﹑B)。

A：Thrb在Aβ42诱导后的BV2细胞中的mRNA表达量；B：Thrb在Aβ42诱导后的BV2细胞中的蛋白表达量。

2.2 过表达Thrb缓解Aβ42诱导小胶质细胞BV2的细胞凋亡 为了验证Thrb在小胶质细胞BV2中的功能，我们在BV2细胞中分别转染pcDNA3.1-Thrb和对照质粒pcDNA3.1，后经浓度为100 ng/ml的Aβ42处理。经Aβ42处理后，细胞活力显著降低，而转染pcDNA3.1-Thrb则显著提高细胞活力(均P<0.05，图2A)；与Control组相比，pcDNA3.1-Thrb显著降低细胞凋亡率(P<0.05，图2B)；同样的，pcDNA3.1-Thrb抑制了caspase-3和caspase-9的表达量(均P<0.05，图2C)。由此说明过表达Thrb缓解了Aβ42诱导的小胶质细胞BV2的细胞凋亡。

A：过表达Thrb对细胞活力的影响；B：过表达Thrb对细胞凋亡的影响；C：过表达Thrb对caspase-3和caspase-9表达量的影响。与 Untreated组比较，*P<0.05；与Control组比较，#P<0.05

2.3 过表达Thrb缓解Aβ42诱导小胶质细胞BV2的炎症和氧化应激 如图3所示，细胞经Aβ42处理后，促炎因子IL-6、TNF-α和NO的水平均显著升高，而pcDNA3.1-Thrb则显著降低上述促炎因子的水平(均P<0.05，图3A-C)；此外，与Control组相比，pcDNA3.1-Thrb显著降低细胞中ROS的含量(P<0.05，图3D)；pcDNA3.1-Thrb提高了细胞中NAD+和ATP的水平(均P<0.05，图3E、F)。由此说明过表达Thrb缓解了Aβ42诱导的小胶质细胞BV2的炎症反应和氧化应激。

2.4 过表达Thrb促进Sirt3和FOX3a表达及sh-Thrb抑制Sirt3和FOX3a的表达 如图4所示，过表达Thrb显著促进Sirt3和FOX3a的表达(均P<0.05，图4A)；与此相反，当干扰Thrb的表达时，Sirt3和FOX3a的表达量均显著降低(P<0.05，图4B)；此外，细胞经Aβ42诱导后Sirt3和FOX3a的蛋白表达水平显著降低(均P<0.05，图4C)。

2.5 Sirt3/FOX3a参与Thrb对Aβ42诱导细胞损伤的保护机制 为了进一步探究Thrb对小胶质细胞BV2作用的分子机制，我们在BV2细胞中分别转染sh-Sirt3或sh-FOX3a或pcDNA3.1-Thrb，检测不同处理组细胞中细胞凋亡和炎症因子以及ROS的含量。结果显示，sh-Sirt3或sh-FOX3a均显著抑制细胞活力(P<0.05，图5A)；此外，sh-Sirt3或sh-FOX3a均促进细胞凋亡(P<0.05，图5B)；进一步研究发现，sh-Sirt3或sh-FOX3a显著提高了细胞中IL-6的水平(均P<0.05，图5C)；pcDNA3.1-Thrb降低了细胞中自由ROS的含量。然而sh-Sirt3或sh-FOX3a提高了细胞中ROS的水平，逆转了pcDNA3.1-Thrb的抑制作用(均P<0.05，图5D)。以上结果说明Sirt3/FOX3a参与了Thrb对Aβ42诱导的细胞损伤的保护机制。

A：过表达Thrb对细胞中IL-6水平的影响；B：过表达Thrb对细胞中TNF-α水平的影响；C：过表达Thrb对细胞中NO水平的影响；D：过表达Thrb对细胞中ROS含量的影响；E：过表达Thrb对细胞中ATP水平的影响；F：过表达Thrb对细胞中NAD+水平的影响。与Untreated组比较，*P<0.05；与Control组比较，#P<0.05

A：过表达Thrb对Sirt3和FOX3a的表达量的影响；B：sh-Thrb对Sirt3和FOX3a表达量的影响；C：Aβ42诱导对Sirt3和FOX3a表达量的影响。与Control或Untreated组比较，*P<0.05；与pcDNA3.1或sh-RNA或50 ng/ml组比较，#P<0.05

3 讨 论

AD是最常见的老年病之一，占70岁以上老年痴呆发病率的60%～70%[10]。Aβ在脑内的积聚被认为是AD发生发展的一个重要事件[11]。Aβ是一种含有39～43个氨基酸的多肽，由分泌酶水解β淀粉样前体蛋白产生，最常见的亚型是Aβ40和Aβ42[12]。Aβ42毒性更强，易于聚集并引起神经毒性[13]。Aβ42的神经毒性作用在AD的进展中起重要作用[14]。据报道，大鼠或猴大脑皮质注射Aβ42后，注射部位出现组织坏死、外周神经细胞丢失、角蛋白增生，且与剂量呈显著相关性[15]。

Thrb在组织分化、生长发育、保持代谢平衡及调节甲状腺激素作用等方面具有重要作用[16]。此外，Thrb对神经发育起着重要的调控作用，是影响脊椎动物神经系统发育的关键介质[17]。Ng等[18]研究发现Thrb的缺失引起小鼠和人的耳聋和甲亢，并导致甲状腺激素抵抗综合征，提示Thrb与神经系统和感觉系统密切相关。本研究发现，Thrb可减轻Aβ42诱导的BV2功能障碍。有趣的是，Thrb能够直接与Sirt3结合，通过调节Sirt3的表达来减轻AD的症状。

A：sh-Sirt3或sh-FOX3a对细胞活力的影响；B：sh-Sirt3或sh-FOX3a对细胞凋亡的影响；C：sh-Sirt3或sh-FOX3a对细胞中IL-6水平的影响；D：sh-Sirt3或sh-FOX3a对细胞中ROS含量的影响。与未处理组比较，*P<0.05；与pcDNA3.1-Thrb组比较，#P<0.05；与pcDNA3.1-Thrb+sh-RNA组比较，$P<0.05

Sirt3主要定位于线粒体，参与多种生物学过程[19]。此外，Sirt3增强线粒体抗氧化谷胱甘肽的表达，减缓动物衰老[20]。众所周知，氧化应激诱导的线粒体功能障碍是AD早期最重要的特征，包括线粒体呼吸酶活性降低、代谢功能障碍等[21-22]。Li等[23]发现在原代海马神经元和AβO处理的动物模型中，HKL可以通过增强Sirt3的活性来调节线粒体功能，包括增加三磷酸腺苷水平和减少活性氧的产生。先前的研究报道，Sirt3广泛参与调节阿尔茨海默病，并在其发展过程中发挥重要作用[24]。Salvatori等[9]报道称，Sirt3的降低与AD患者的线粒体功能障碍有关，Sirt3的表达随着AD的进展而降低。

在本研究发现，Aβ42显著抑制Thrb表达且具有剂量依赖性；过表达Thrb显著降低Aβ42诱导的小胶质细胞BV2的细胞凋亡率和炎症因子的水平，并显著缓解Aβ42诱导的小胶质细胞BV2的氧化应激；进一步的研究结果表明，Thrb显著促进Sirt3和FOX3a的表达且Sirt3/FOX3a参与了Thrb对Aβ42诱导的细胞损伤的保护机制。由以上结果说明Thrb能够缓解小胶质细胞BV2氧化应激和凋亡，降低细胞损伤，其作用机制是通过调控Sirt3/FOX3a信号通路来实现的。

综上所述，本研究证明Thrb显著降低Aβ42诱导的小胶质细胞BV2的细胞凋亡率，并显著缓解细胞氧化应激，其作用机制是通过调控Sirt3/FOX3a信号通路来实现的，这一结果能够为阿尔兹海默症的临床治疗和诊断提供分子基础。