下调GIT1对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡能力及周期分布的影响

缪文青 张阳 严海冬

临床医学将发生于机体乳腺上皮组织的恶性肿瘤称为乳腺癌，是一种临床较为常用的恶性肿瘤[1]。乳腺癌患者主要临床表现为乳腺肿块、乳头溢液等，严重威胁患者身体健康[2,3]。乳腺癌症状发病具有较为明显的性别差异，据世界卫生组织调查数据显示，99%左右的乳腺癌患者为女性[4,5]。在欧美地区，乳腺癌发病率高达15%左右，相比之下，我国乳腺癌发病率较低，但是近年来一直呈现上升趋势，作为一项公共卫生问题引起广大专家的关注，许多学者致力于乳腺癌临床治疗的研究[6,7]。本文研究中设计实验，对乳腺癌MCF-7细胞中GIT1蛋白表达进行靶向调控，旨在探究下调GIT1对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡能力及周期分布的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 研究细胞：乳腺癌MCF-7细胞(中国医学科学院)。兔抗小鼠Bcl-2、Bax抗体(Sigma公司)；大鼠抗小鼠caspase3抗体(Gibco 公司)；小鼠抗大鼠MMP-9抗体(Hyclone公司)；兔抗大鼠ICAM-1抗体(BD公司)。本实验获我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:在40℃的环境中对冻存的乳腺癌MCF-7细胞进行火浴处理(40℃)，之后进行充分摇晃，将摇晃均匀的乳腺癌MCF-7细胞置于2 ml的培养基(10%PBS、1%双抗(青链霉素)RPMI-1640培养基500 ml)之内，之后使用2 000 r/min的离心机进行离心处理，进行重悬处理后将细胞传代，使用CO2培养箱对培养基培养24 h、换液，细胞融合率达90%后传代。

1.2.2 慢病毒载体构建及分组:GIT1基因序列根据质粒特点进行引物设计，引入SacⅠ酶切位点(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)，GIT1下游序列：5’-GGTTGACTGGCAGGAAGG-3’。GIT1上游序列：5’-ATGGATGTGTATGACGAAGTG-3’。正反链混合后加入退火缓冲液，96℃反应4 min，室温冷却，生成双链。使用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1，100倍稀释退火产物之后与其连接，20℃下水浴孵育过夜，使用大肠杆菌DH5α转化，第2天选择单克隆菌落，在30 μg/ml Kana的LB培养液中接种，2 000 r/min离心处理，37℃下震混，孵育过夜。少量抽提质粒后使用SacⅠ酶切进行鉴定(由宝生物工程(大连)有限公司完成)，分为空白组、上调GIT1组和下调GIT1组,重悬处理后分别加入4 μg 0.9%氯化钠溶液、pcDNA3.1-GIT1、GIT1siRNA，电击处理后室温环境下存放120 min，将3组细胞加入6孔、96孔培养板中，置于培养箱内进行培养取出后加入含800 μg/ml G418的培养基再次培养。

1.2.3 细胞增殖检测:MTT法检测3组细胞增殖能力。将3组细胞加入96孔板中，分别于12、24、48、72 h 后在每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，弃培养液，加入150 μl的DMSO，酶标仪在498波长处检测每孔OD值。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡情况:常温环境中使用20 μg/ml蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，使用PBS缓冲液进行彻底清洗，之后将平衡缓冲液100 μl加入其中，室温环境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反应液100 μl，避光、室温环境中孵育1 h，之后加入100 μl SSC溶液，常温环境中静置20 min后进行清洗3次，之后使用DAPI进行复染，避光培养10 min后再次进行浸洗，封片观察。DAPI复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞细胞核呈绿色，取每切片3视野进行观察、计算细胞凋亡率，计算平均值。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期分布：将3组细胞传代至5孔板，并将其置于5% CO2、37℃环境中培养，之后添加0.25%胰蛋白酶进行消化，离心处理10 min，使用PBS缓冲液进行清洗，再次离心处理，之后添加1 ml PI染液，置于常温、避光环境60 min，进行特异荧光标记后按照流式细胞仪操作方法检测细胞周期分布。

1.2.6 细胞侵袭情况:使用Transwell小室实验检测。2 h前湿化小室。上室加入细胞悬液200 μl，在下室加入含10%胎牛血清的细胞培养液，在培养箱中培养24 h。用PBS冲洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。染色后放在显微镜下观察计数。

1.2.7 细胞迁移情况:使用细胞划痕实验检测。将细胞使用胰酶消化制成细胞悬液，接种于6孔板。使用10枪尖垂直于孔板底部画直线，PBS缓冲液清洗3次。常温培养24 h拍照计算划痕。

1.2.8 Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-9、ICAM-1表达:使用PBS缓冲液对标本冲洗之后裂解30 min，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，添加蛋白缓冲液后进行电泳，10 min后将电转膜置于10%的牛奶中浸泡，常温环境下封闭90 min。之后结合一抗、稀释，孵育1 d，取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色，对Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-9、ICAM-1相对表达量进行检测。

2 结果

2.1 3组细胞增殖率、凋亡率比较 在第24、48、72小时，上调GIT1组细胞增殖率高于空白组，凋亡率低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调GIT1组细胞增殖率低于空白组、上调GIT1组，凋亡率高于空白组、上调GIT1组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组细胞增殖率、凋亡率比较

2.2 3组细胞周期分布情况比较 上调GIT1组处于G1期的细胞比例低于空白组，处于S、G2期的细胞比例高于空白组，且下调GIT1组处于G1期的细胞比例均高于空白组、上调GIT1组，处于S、G2期的细胞比例低于空白组、上调GIT1组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组细胞周期分布情况比较

2.3 3组细胞侵袭、迁移能力比较 上调GIT1组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调GIT1组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数均低于空白组、上调GIT1组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图1、2。

表3 3组细胞侵袭、迁移能力比较 个,

2.4 3组细胞Bcl-2、Bax、caspase-3相对表达量比较 上调GIT1组细胞Bcl-2相对表达量低于空白组，Bax、caspase-3相对表达量高于空白组，且下调GIT1组细胞Bcl-2相对表达量高于空白组、上调GIT1组，Bax、caspase-3相对表达量均低于空白组、上调GIT1组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4，图3。

图3 Bcl-2、Bax、caspase-3表达WB图；A 空白组；B 上调GIT1组；C 下调GIT1组

表4 3组细胞Bcl-2、Bax、caspase-3相对表达量比较

2.5 3组细胞MMP-9、ICAM-1相对表达量比较 上调GIT1组细胞MMP-9、ICAM-1相对表达量均高于空白组，且下调GIT1组细胞MMP-9、ICAM-1相对表达量均低于空白组、上调GIT1组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图4。

表5 3组细胞MMP-9、ICAM-1相对表达量比较

图4 MMP-9、ICAM-1表达WB图;A 空白组；B 上调GIT1组；C 下调GIT1组

3 讨论

有学者认为乳腺癌症状的发生具有一定的规律性，并总结了许多乳腺癌发病高危因素，但目前临床医学尚未将乳腺癌症状的发病机制研究透彻[8,9]。有专家学者致力于乳腺癌症状发病机制、治疗方法的研究，旨在寻找一个有效的治疗靶点对乳腺癌症状进行治疗[10,11]。作为一种多区域骨架蛋白，GIT1表达的变化与细胞增殖、凋亡能力具有密切联系。有学者在研究中表示，GIT1在HeLa细胞中呈现高表达，下调GIT1表达对细胞增殖、迁移具有一定的抑制作用。但是目前关于调控GIT1表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡能力、周期分布等生物学行为影响的研究鲜有报道。

癌组织的发生发展与细胞增殖、凋亡能力的变化密切相关[12]。有研究表明，乳腺癌组织细胞增殖率较高、凋亡率较低，调控乳腺癌癌细胞增殖、凋亡能力对乳腺癌组织发生发展具有重要的抑制作用，是临床治疗乳腺癌的关键[13]。本文研究结果显示，下调GIT1蛋白表达的乳腺癌MCF-7细胞增殖率相对较低、凋亡率相对较高，说明下调GIT1蛋白表达能够有效抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡，从而抑制乳腺癌MCF-7细胞的不断增殖、发展。

细胞活动的基础生物学行为是周期分布，细胞周期分布的变化与细胞增殖、凋亡状况的变化密切相关[14,15]。细胞周期分为DNA合成前期、合成期、合成后期，将癌细胞阻滞在DNA合成前期，能够有效抑制癌细胞增殖、扩散。本文研究结果显示，下调GIT1蛋白表达的乳腺癌MCF-7细胞处于G1期的细胞比例较高，处于S、G2期的细胞比例较低，说明下调GIT1蛋白表达能够阻滞乳腺癌细胞周期分布，抑制乳腺癌细胞增殖，促进乳腺癌细胞凋亡，从而影响乳腺癌细胞的不断发展。

有研究表明，癌细胞的不断发展扩散与其不断侵袭、迁移具有密切联系，抑制癌细胞的侵袭、迁移是抑制癌组织不断生长、扩散的关键[16,17]。本文研究结果显示，下调GIT1蛋白表达的乳腺癌MCF-7细胞侵袭、迁移细胞数相对较少，说明下调GIT1蛋白表达能够抑制乳腺癌细胞的侵袭、迁移。

癌细胞增殖、凋亡能力的变化与细胞凋亡蛋白相对表达量的变化密切相关。Bcl-2、Bax是线粒体细胞凋亡通路中的重要基因，二者表达的变化与细胞凋亡密切相关[18,19]。caspase-3作为caspase家族重要成员，与细胞凋亡密切相关[20]。本文研究结果显示，下调GIT1蛋白表达的乳腺癌MCF-7细胞Bcl-2相对表达量较高，Bax、caspase-3相对表达量较低，说明下调GIT1蛋白表达能够调控细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达，从而起到促进乳腺癌细胞凋亡、抑制乳腺癌细胞增殖、发展的作用。ICAM-1、MMP-9表达的变化与癌细胞侵袭、迁移能力具有密切联系[21,22]。本文研究结果显示，下调GIT1蛋白表达的乳腺癌MCF-7细胞ICAM-1、MMP-9相对表达量相对较低，说明下调GIT1蛋白表达能够下调ICAM-1、MMP-9相对表达量，从而起到抑制乳腺癌细胞侵袭、迁移的作用。

综上所述，下调GIT1蛋白的表达能够抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移，调控细胞周期分布，促进乳腺癌MCF-7细胞凋亡，调控Bcl-2、Bax、caspase-3、MMP-9、ICAM-1蛋白相对表达量，为乳腺癌的临床治疗提供一定的参考依据。