细颗粒物通过诱导小鼠γδT/Th17细胞分泌白细胞介素-17A加剧肺部炎症

侯文肖，吴依娜，丛鲁红，李 涛，张洪春，段 军★

（1.中日友好医院 外科重症医学科，北京 100029；2.北京中医药大学 研究生院，北京100029；3.中日友好医院 教育处，北京 100029；4.中日友好医院 保健医疗部，北京 100029）

近年来，空气环境污染对人类健康的影响越来越大，尤其是大气颗粒物的影响已成为一个严重的全球公共卫生问题[1]。并且在过去的几十年里，很多证据表明大气颗粒物能够诱发、加剧呼吸道疾病，如哮喘、慢阻肺、肺纤维化、甚至癌症[2，3]。其实，细颗粒物（PM2.5）是能够引起气道伤害的主要空气污染物[4]。它可以通过影响机体免疫系统导致炎性介质的过度释放及炎性因子聚集，产生炎性反应扰乱肺组织局部微环境的稳定，进而造成组织损伤并且降低机体防御功能及修复能力。现有证据表明[5，6]，白细胞介素17A（IL-17A）参与了肺损伤，但其对PM2.5 诱导的肺损伤作用机制仍然未知。在此，我们将明确IL-17A 在PM2.5 导致的肺损伤机制中可能产生的作用，并探讨PM2.5 诱导的肺损伤小鼠模型中分泌IL-17A 的关键细胞类型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30 只C57BL/6J 雄性小鼠，6～7 周龄，体重20～30g，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。

15 只IL-17A 基因敲除 （IL-17A-/-）C57BL/6J雄性小鼠6～8 周龄，体重25～35g，购买自赛业（广州） 生物科技有限公司。饲养于中日友好医院动物实验中心（SPF 级）。本实验经中日友好医院研究伦理委员会审核批准，实验过程符合动物实验研究管理规定。

1.2 造模与分组

将15 只野生型小鼠作为对照组，另外15 只野生型小鼠和15 只IL-17A-/-小鼠作为实验组。将浓度为2mg/ml 的PM2.5 以气管内滴注方式进行造模，造模持续9d，每3d 进行一次气管内滴注，每只小鼠50μl。对照组和实验组野生型、IL-17A-/-中各5 只小鼠分别在模型构建的第3d、6d、9d 处死；然后将其肺组织和肺泡灌洗液进行病理染色、RT-qPCR、流式和ELISA。

1.3 统计学方法

应用SPSS21.0 软件进行统计分析，Graphpad Prism 5 软件作图；计量资料符合正态分布，表示为χ±s。组间比较采用方差分析进行两两比较；对于计量资料不符合正态性及方差齐性分布，组间比较采用非参数检验。

2 结果

2.1 PM2.5 可刺激小鼠肺组织中γδT 和Th17 细胞数量增加（图1，见封三）

图1 A.实验组野生型小鼠和对照组小鼠肺组织的HE染色分析（×400）。B.肺泡灌洗液分析，左图示总细胞数，右图示中性粒细胞数，* 与对照组相比，P ＜0.05。C～F.流式细胞术分析在PM2.5造模后的第3d、6d、9d时IL-17A+细胞的数目。* 与第3d相比，P ＜0.05，# 与第6d相比，P ＜0.05。

在实验组野生型小鼠中，肺组织经HE 染色后显示被大量炎性细胞浸润（图1A）。通过对肺泡灌洗液细胞统计分析提示：全细胞数量增加，中性粒细胞显著增加（P＜0.05，图1B）。在PM2.5 造模后的第3d、6d、9d，实验组野生型小鼠肺组织中γδT 和Th17 细胞的含量逐渐增加，并具有统计学差异（P＜0.05，图1D～1F），而对照组小鼠肺组织中γδT 和Th17 细胞的含量变化则没有统计学差异（P＞0.05，图1C、1E 和1F）。

2.2 PM2.5 可通过诱导小鼠肺组织中γδT 和Th17 细胞增加，刺激分泌IL-17A（图2，见封三）

研究表明γδT 和Th17 细胞都可以分泌IL-17，Th17细胞在2005年被发现和命名，是在TGF-β 和IL-6 的共同诱导下由CD4+T 细胞分化而来，它最重要的效应因子就是IL-17A[7～9]。因此，我们使用RT-qPCR 方法在实验组野生型模型建立的第3d、6d、9d 检测实验组小鼠Th17 的mRNA表达，发现Th17 的mRNA 表达水平呈上升趋势（P＜0.05，图2A）。通过ELISA 检测对照组和实验组野生型小鼠肺泡灌洗上清液中炎性因子IL-1β和TNF-α 的含量，结果表明与对照组相比，实验组野生型小鼠在造模后第9d，IL-17A、IL-1β 和TNF-α 的含量显著增加（P＜0.05，图2B、2C）。同时，还应用RT-qPCR检测了2 组小鼠TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表达水平（P＜0.05，图2D），这也证实了ELISA 的结果。通过对IL-17A-/-小鼠肺组织HE 染色研究表明，与造模第9d 的实验组野生型小鼠相比，IL-17A-/-组小鼠肺组织中的炎性细胞浸润显著减少（图2E）。与第9d 实验组野生型小鼠相比，IL-17A-/-组小鼠肺泡灌洗上清液中IL-1β 和TNF-α 的含量显著降低（P＜0.05，图2F），全细胞数量及中性粒细胞数量显著减少（P＜0.05，图2G），并且TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表达水平呈明显降低趋势（P＜0.05，图2H）。

3 讨论

近年来，流行病学数据[10]已经表明，肺、心血管疾病以及癌症的发病率和死亡率与我们日常生活周围环境中PM2.5 的浓度有关，同时也带来了较重的社会经济负担。并且即使短期内PM2.5 浓度的升高也可能导致死亡率和发病率的增加[11]。PM2.5 通过沉降和扩散过程沉积在肺实质中，特别是肺泡中，也可以通过循环系统到达心、肝、脾、脑[12]，导致全身多器官受损。因此，本实验研究旨在证明PM2.5 诱导肺部炎症反应的细胞机制。

组织损伤的炎症反应中，在巨噬细胞、树突细胞等抗原提成细胞作用下，辅助性T 细胞（Th 细胞）被激活，开启细胞免疫。众所周知，Th 细胞表面标志物为CD4。初始CD4+T 细胞接受抗原刺激后，在不同的条件下可分化成不同亚型的T 细胞，执行不同功能，如Th1 细胞、Th2 细胞。Th17细胞在21 世纪初被发现和命名，其与Th1 细胞、Th2 细胞不同，是在TGF-β 和IL-6 的共同诱导下由CD4+T 细胞分化而来。Th17 细胞主要分泌IL-17A（IL-17）、IL-17F、IL-21、IL-22，其中最重要的效应因子是IL-17A[7]。IL-17A 具有强大的致炎性，参与肿瘤、感染和自身免疫性疾病等多种炎症性疾病，其受体IL-17R 表达多种细胞表面，如巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。IL-17A 与受体（IL-17R）结合后，可通过MAPK、NF-κB、ERK 等通路[8，9]，刺激多种细胞分泌多种促炎因子，如IL-6、IL-8、GM-CSF，从而导致炎症的放大。但是，最近的实验结果表明，Th17细胞不是IL-17A 的唯一来源。IL-17A 也能够由γδT 细胞、中性粒细胞和CD8 T 细胞分泌。

近年研究报道，IL-17A 参与肺脏损害，包括在哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病中[3，7，9，10]。Th17细胞来源的IL-17A 增加气道高反应性、加重哮喘[13]。在博莱霉素诱导的肺纤维化模型中，IL-17A被认为是纤维化过程高度依赖的分子[14]。国内学者在既往研究COPD 的肺损伤模型中发现，肺组织中IL-17A 显著升高，同时观察到肺组织中γδT+细胞浸润增加[15]。在肾脏纤维化研究中，敲除IL-17A 基因后，病灶处的淋巴细胞浸润明显减少，并且证明γδT+和Th17 细胞是IL-17A 共同的细胞来源，同时体外实验证明IL-17A 剂量依赖性的促进单核-巨噬细胞迁移。

我们发现，PM2.5 促进γδT/ Th17 细胞中IL-17A 的分泌并加剧炎症反应。而且已知IL-17A 在肺损伤过程中存在大量表达[15，16]。有证据表明，γδT 细胞和Th17 细胞均分泌IL-17A，从而加剧炎症反应[16]。感染初期产生IL-17A 的最多是γδT细胞，这时Th17 细胞对IL-17A 主要起到一定保护性作用。Baldeviano 等[17]发现，IL-17A 能够刺激扩张型心肌病的发展，若抑制IL-17A 可以减少由心肌炎引起的心肌纤维化。Smith 等[18]人的研究发现，阻断IL-17A 可以降低ApoE2/2 小鼠动脉粥样硬化的发生率，Wilson 等[19]人也证明了BLM介导的肺纤维化依赖于IL-17A。

综上所述，这项动物实验研究证明了PM2.5可以通过诱导小鼠γδT 和Th17 细胞分泌IL-17A，从而加剧肺部炎症反应。对于PM2.5 诱发和加重的多种呼吸系统疾病，目前还缺乏有效的防治手段。但我们对IL-17A 导致的肺损伤作用有了新的认识，可针对PM2.5 诱发的肺部疾病寻求新的干预措施。有研究[20，21]发现固本止咳中药可以减少肺组织中γδT 和炎症细胞的浸润，为我们下一步研究中医药干预PM2.5 导致的肺损伤指明了方向。笔者认为，深入而系统地研究空气污染尤其是PM2.5 所致人体危害，特别是呼吸系统危害，具有重要的科学意义和临床价值，对减轻社会经济负担亦有积极作用。