生物基表面活性剂七叶皂素的界面行为

郑子睿，李子璐，赵克非，吴天岳，张晨辉，高玉霞，2，杜凤沛

（1.中国农业大学理学院,北京100193；2.复旦大学聚合物分子工程国家重点实验室,上海200433）

生物基表面活性剂因其来源广泛、可再生、环境友好等优点，已成为替代石油基表面活性剂的最优选择，受到越来越多研究者的关注［1~3］.这些源于自然的绿色表面活性剂的结构多样性决定了其功能多样性，独特的两亲性结构使其表现出不同于传统小分子表面活性剂的表面/界面性质及自组装行为［4，5］，具有良好的分散、乳化、增稠、絮凝以及独特的生理等性能，在石油工业、农业、食品、医药、日化产品等诸多领域有较大的应用价值［6，7］.

皂苷是一类主要存在于植物体内的非离子生物基表面活性剂，由疏水性苷元和亲水性糖链两部分组成，具有两亲性［8］.在界面（油-水界面和气-水界面）上，皂苷疏水部分以并排方式连接与空气（或油相）接触，亲水的糖链之间并排连接与水相接触，所形成的独特吸附层与界面膜使其常用作泡沫稳定剂或乳化剂，表现出与传统小分子表面活性剂完全不同的效果［9~12］.Tcholakova等［13］发现茶皂苷在气-水界面吸附时，分子垂直于界面取向排列，通过糖基间的强氢键作用形成密集吸附层，具有复杂的黏弹性行为和极高的弹性模量.Yang［14］利用茶皂苷可以在油-水界面诱导下发生纤维化自组装形成界面网络膜的特性，构建了乳液、油粉和油胶体系.最近，本课题组［15，16］以三萜皂苷甘草酸为乳化剂构建了高农用油含量的乳液凝胶，并利用其组装形成的纳米纤维抑制了液滴在疏水表面的弹跳，拓展了皂苷表面活性剂在农业领域的应用.七叶皂素（Escin，Scheme 1），又称七叶皂苷，是一种典型的三萜皂苷，结构不同于茶皂苷与甘草酸.目前关于七叶皂素的研究仅局限于生物活性的探究及在医药领域的应用［17］，而系统探索其界面性质和开发其作为生物基表面活性剂应用潜力的研究却鲜有报道.因此，研究七叶皂素在气-液、液-液、固-液界面的组装行为有利于拓展其在医药、食品、农业等诸多领域的应用.

本文以天然三萜皂苷七叶皂素为研究对象，通过吊片法、悬滴法、高速摄像机动态拍摄法，分别研究了七叶皂素分子在气-液、液-液（油-水）、固-液界面上的界面行为（Scheme 1）.考察了以七叶皂素为乳化剂制备乳液的稳定性，以及七叶皂素对液滴在疏水固体表面润湿铺展行为的调控规律，从分子层次角度分析了作用机理.本研究对于深入理解生物基表面活性剂的界面行为及拓展其应用具有重要的借鉴意义.

Scheme 1 Molecular structure of escin and illustration of interfacial behaviors at the air/water,oil/water and solid/liquid interfaces

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

七叶皂素（纯度95%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；溶剂油150#（鹏辰新材料科技股份有限公司）；聚四氟乙烯（PTFE）疏水膜（海宁科诺过滤设备有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水系统，德国默克密理博公司）.

DCAT 21型表界面张力仪（德国德菲公司）；OCA 20型视频光学接触角测量仪（德国德菲公司）；HITACHI HT7700型透射电子显微镜（TEM，日本日立高新技术公司）；SM-1000C型超声波材料分散器（南京舜玛仪器设备有限公司）；MS20型乳液稳定性分析仪（德国德菲公司）；Leica-DM1000型光学显微镜（德国徕卡公司）；Nano ZS90型激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）；i-SPEED 220型高速摄像机（英国ix cameras公司）；DY2T型黏度仪（美国博勒飞公司）.

1.2 实验过程

1.2.1 七叶皂素溶液的配制将0.1131 g七叶皂素溶解于100 mL超纯水中，超声5 min后在80℃水浴中加热1 h，冷却至室温得到1×10-3mol/L七叶皂素母液.取一定量的母液用超纯水稀释，得到一系列所需浓度（5×10-4，1×10-4，5×10-5，1×10-5，5×10-6，1×10-6，5×10-7和1×10-7mol/L）的七叶皂素溶液，用于测试.

1.2.2 溶液表面张力的测定使用表界面张力仪，利用吊片法在25℃恒温水浴下测定七叶皂素溶液的静态表面张力.铂片的长度、宽度和厚度分别为10.0，19.9和0.2 mm.分别测定超纯水以及不同浓度七叶皂素溶液（可溶解浓度范围内）的静态表面张力值，每个样品重复测3次.

1.2.3 聚集体形貌的观察将10 μL 1×10-3mol/L七叶皂素溶液滴加在碳支持膜表面，片刻后用毛细管吸走多余液体，室温下自然干燥.采用TEM进行观察，电压为80 kV.

1.2.4 油-水界面张力的测定使用视频光学接触角测量仪，利用悬滴法测定溶剂油150#和不同浓度七叶皂素溶液的油-水界面张力.溶液为内相，溶剂油150#为外相.将七叶皂素溶液置于气密性良好的注射器（针管外径为1.65 mm）中，利用步进马达将溶液（8 μL）注射到装有溶剂油150#的玻璃皿中，CCD摄像机同步记录测定过程的液滴状态（每次测定25 min），软件通过液滴形状分析计算出界面张力.分别测定超纯水以及不同浓度七叶皂素溶液与溶剂油150#的界面张力，每个样品重复测3次.

1.2.5 乳液的制备在80℃恒温水浴并持续搅拌下，将10 mL溶剂油150#逐滴缓慢加入40 mL 1×10-3mol/L七叶皂素溶液中.持续恒温加热搅拌10 min后，立即在功率比80%条件下用变幅杆（Φ=10）超声分散5 min，冷却至室温，得到乳液.5×10-4，1×10-4mol/L七叶皂素溶液也按上述步骤制得乳液，用于测试.

1.2.6 乳液稳定性的测试使用乳液稳定性分析仪测试.每个新制样品在25℃下测定24 h，每1 h进行一次扫描.扫描高度范围为0~56.5 mm，扫描速率为12.5 mm/s.

1.2.7 乳液在光学显微镜下的表征取少量新制乳液稀释至透明，取一滴在光学显微镜下观察并连接主机拍照记录.

1.2.8 乳液粒径和Zeta电位的测定取稀释至透明的新制乳液，采用激光粒度仪分别测定粒径和Zeta电位.每个样品的每个参数重复测定3次，取强度报告进行结果分析.

1.2.9 液滴动态撞击过程的表征将PTFE疏水表面水平放置，在30 cm高度用注射器打出液滴，使用高速摄像机以3000 fps进行倾斜视角拍摄记录.测定超纯水以及不同浓度七叶皂素溶液，每个样品重复测定3次.用配套软件i-SPEED suite处理视频，得到撞击过程的参数.

1.2.10 溶液黏度的测定利用黏度仪依次测定纯水及不同浓度（1×10-4，5×10-4，1×10-3mol/L）七叶皂素溶液的黏度.将适量七叶皂素溶液加入ULA超低黏度适配器中，用304#转子（直径25 mm）分别以1，5，10，20，40和60 r/min转速进行测试，每个转速维持2 min，设置循环水浴温度为25℃.

2 结果与讨论

2.1 七叶皂素在气-液界面的吸附

首先，采用吊片法测量了不同浓度七叶皂素溶液的表面张力.由于七叶皂素溶解度的限制，当浓度超过1×10-3mol/L时会有少量固体物质析出，影响测试结果，故表面活性测试的浓度范围为1×10-7~1×10-3mol/L.如图1（A）所示，随着七叶皂素浓度的增加，表面张力呈现先基本不变、后快速下降、最后达到平衡的3个阶段.这是由于浓度低于1×10-5mol/L时，只有少量七叶皂素分子吸附在气-液界面，表面张力基本不变；然后随着浓度增加，越来越多的分子迁移并吸附在气-液界面，使溶液表面张力快速下降；当分子在界面吸附达到饱和（5×10-4mol/L）后，开始在体相聚集形成胶束，表面张力不再改变.可知，七叶皂素的临界胶束浓度（cmc）为5×10-4mol/L，对应的表面张力（γcmc）为42.1 mN/m.图1（B）为七叶皂素形成聚集体的TEM照片，胶束大小约为20 nm.

此外，分别计算了七叶皂素的效率因子（pC20）、表面最大吸附量（Γm）、七叶皂素分子在气-液界面的最小横截面积（Amin），以此进一步描述表面活性剂分子在界面的吸附行为［18］：

式中：C20（mol/L）为表面张力下降20 mN/m需要的浓度；n为溶质种类数，对于非离子型表面活性剂七叶皂素，n=1；R=8.314 J·mol-1·K-1，为摩尔气体常数；T（K）为热力学温度；γ为表面张力；c（mol/L）为浓度；L=6.02×1023，为阿伏伽德罗常数.

计算可得pC20为4.08 mol/L，Γm为2.47 μmol/m2，在吸附完全时，每个分子所占液面的Amin为0.67 nm2.较大的pC20和较小的Γm说明七叶皂素有较好的降低表面张力的作用［19］.采用Chem3D对七叶皂素分子结构进行能量优化（MM2模式），并对分子尺寸进行测量，结果如图1（C）所示.分子中亲水部分2个糖基团之间的距离为1.13 nm，宽度为0.57 nm，可计算出亲水基团的截面积近似为0.64 nm2，与吸附参数Amin的0.67 nm2接近.由此，认为七叶皂素分子在气-液界面上按照图1（D）的方式排列，亲水的糖基团在相邻分子间多重氢键作用下紧密排列在水相内侧，疏水的三萜骨架排列在气相一侧，骨架间距离较大，排列较为疏松.界面吸附饱和后，多余的七叶皂素分子趋向于在体相内聚集，将疏水的三萜环包裹在分子内侧，糖基暴露在外侧水环境中，形成稳定的胶束聚集体.

Fig.1 Equilibrium surface tension of escin with different concentrations(A),TEM image of escin aggregates(B),optimized molecular structure of escin by Chem 3D software(C),schematic illustration of the adsorption layer of escin at the water⁃air interface(D)

2.2 七叶皂素在油-水界面的吸附

七叶皂素在油-水界面的吸附行为决定了其是否可作为乳化剂用于乳液的制备.选择能明显降低表面张力的5个浓度（1×10-5，5×10-5，1×10-4，5×10-4和1×10-3mol/L），以农药中常用的溶剂油150#作为外相，将不同浓度的七叶皂素溶液打入溶剂油中，通过光学测量和形状分析，测定界面张力随时间变化的情况［15］.纯水与溶剂油150#的界面张力为33.5 mN/m，不随时间的延长而变化，而各浓度七叶皂素溶液的界面张力均随时间的延长先快速下降而后达到平衡［图2（A）］，这是由于纯水中不存在七叶皂素分子的迁移，而七叶皂素溶液中分子由体相向界面迁移，致使界面张力下降.此外，平衡界面张力随浓度的增加逐渐减小后趋于稳定［图2（B）］，可归因于七叶皂素分子从体相扩散吸附在油-水界面层，随着浓度增加，吸附量增加，界面张力降低.当浓度达到5×10-4mol/L，即临界胶束浓度时，界面层上分子吸附趋于饱和，形成黏弹性的界面层，空间减少，阻碍增大.分子间的相互作用（静电排斥力）使得七叶皂素分子向界面扩散逐渐减少，进而界面张力趋于稳定.

Fig.2 Dynamic interfacial tension of escin solutions with different concentrations(A)and variation of equilibrium interfacial tension with the concentration of escin(B)

2.3 基于七叶皂素的乳液性质

上述实验证明七叶皂素可以很好地降低水与溶剂油150#之间的界面张力，可以作为二者间的乳化剂.因此，选择能显著降低油-水界面张力的3个浓度（1×10-4，5×10-4和1×10-3mol/L），利用超声乳化法制备了水油体积比为4∶1的乳液，并对其粒径、Zeta电势、外观及沉降稳定性等性质进行表征.

首先使用激光粒度仪表征了新制乳液的粒径大小及分布情况，如图3（A1）~（A3）所示.随着七叶皂素浓度从1×10-4mol/L增大到1×10-3mol/L，乳液平均粒径Z-Ave从约2.4 μm下降至1.4 μm，单分散系数（PDI）逐渐降低，粒径分布范围逐渐变窄，表明乳液稳定性得以提高［20］.光学显微镜表征结果［图3（C1）~（C3）］也印证了该结论.

Fig.3 Particle size and distribution of the fresh emulsion with different escin dosages(A1-A3),Zeta potential of the fresh emulsion with different escin dosages(B1-B3),the micrographs of the fresh emulsion with different escin dosages under the optical microscope(C1-C3)

此外，还测试了不同浓度新制乳液的Zeta电势，结果如图3（B1）~（B3）所示.从七叶皂素分子结构分析，亲水部分的羧基使乳液的Zeta电势为负.随着七叶皂素浓度从1×10-4mol/L增加到1×10-3mol/L，乳液Zeta电势从−39.7 mV略微增大至−40.7 mV.3种浓度下Zeta电势相差不多，且绝对值均大于30 mV，粒子间趋向于相互排斥，不容易发生聚结等现象，有利于乳液的稳定［21，22］.可见，以七叶皂素为乳化剂的新制乳液具有较低粒径和较高Zeta电势（绝对值），保证了其稳定性，且随着七叶皂素浓度升高，乳液明显趋于更稳定的状态.这是由于相对于气-水界面，油-水界面为两亲分子提供了相界面迁移的定向力，并诱导分子界面重排，七叶皂素分子亲油端插入油相，亲水端插入水相，在油-水界面吸附形成稳定的界面膜.浓度的增加使界面膜强度增加，乳液粒径变小.当界面分子吸附接近饱和时，外侧排列的亲水基团上的羧基官能团之间产生静电排斥力，有利于乳液的稳定.

为了直观地了解乳液状态及贮存稳定性情况，分别拍摄了新制乳液和放置24 h，3 d，7 d的乳液外观图.如图4（A）所示，新制乳液均呈现均匀乳白色，放置24 h后则有分层现象出现，随着七叶皂素浓度下降，分层现象愈加明显.放置3 d后各浓度的乳液均呈现相同的完全分层现象.

根据分散体系的光散射原理，当光线射向乳液样品时，会发生散射，通过仪器由乳液底部到顶部扫描检测背散射光的强度，即可快速分析乳液的聚结、分层等现象［23~25］.据此，采用MS20型乳液稳定性分析仪测定了不同浓度七叶皂素乳液在24 h内的稳定性，如图4（B）~（D）所示.随着时间延长，乳液下半部分背散射率呈明显减小趋势，同时顶部背散射率逐渐增大，反映了下层析水，油相上浮的分层问题.而随着七叶皂素浓度增加，下部背散射率的变化值明显减小.以高度为20 mm处为例，当七叶皂素溶液浓度为1×10-4mol/L时，在24 h内背散射率下降超过20%，测量结束时在此高度已成半透明状态；而当浓度增大到5×10-4mol/L，背散射率下降约15%，分层得到了明显抑制；进一步增大浓度到1×10-3mol/L，24 h内此处的背散射率下降值不到10%，该乳液在该时间范围内较为稳定.可见，七叶皂素浓度为1×10-4和5×10-4mol/L时，在24 h内分层较明显，前者的分层程度略大于后者，当浓度为1×10-3mol/L时，分层得到明显抑制，较为稳定，该现象与贮存稳定性表征结果一致［图4（A）］.这是由于两亲性的七叶皂素分子结构具有较多的含氧基团（羟基和羧基），在油-水界面层具有强分子间作用（氢键），高浓度形成的界面膜的收缩弹性强于低浓度，在油-水界面发生形变时，界面膜产生相应形变而非解吸附，因此高浓度七叶皂素所形成的乳液稳定性相对更好［26］.

虽然最高浓度（1×10-3mol/L）七叶皂素乳化的乳液贮存稳定性较好，但由于分散相与连续相之间的密度差，依然会在较短时间内出现分层现象，达不到非常稳定的贮存效果.对此，后续可通过调整乳液组成比例或复配其它乳化剂等方法进行改进，以提升乳液稳定性.

2.4 七叶皂素溶液在疏水表面的撞击行为

液滴在固体表面的润湿和铺展对许多工农业生产过程具有重要意义.如农药药液在剂量传递过程中，常因作物叶片疏水无法在其表面有效润湿而发生破碎飞溅、弹跳滚落等现象，药液进入环境造成污染的同时也影响了施药效率［27］.液滴在固体表面的润湿是一种固-液界面现象，表面活性剂的引入可以有效调控该过程.为探究七叶皂素对液滴固-液界面相互作用的调控效果，以疏水的PTFE膜为固体基底（接触角为137°），将添加七叶皂素的液滴从30 cm高处自由下落至PTFE表面，并使用高速摄像机记录液滴下落、铺展、弹跳的全过程.

图5 （A）展示了水和不同浓度七叶皂素溶液撞击PTFE疏水表面的动态过程.可以看出，水在撞击PTFE表面后完全弹起，而且有较多飞溅碎裂，在80 ms时并不能润湿疏水表面.七叶皂素浓度为1×10-4mol/L时，液滴在撞击后仍有较大程度的反弹，但未能完全弹起，且平衡后在一定程度上实现了铺展.当浓度升高至5×10-4mol/L，液滴的反弹得到了明显抑制，平衡后在疏水表面的沉积和铺展有所改善.浓度进一步升高至1×10-3mol/L时，液滴不再有明显的反弹趋势，且碎裂现象也得到了很好的抑制，平衡后能在表面很好地沉积和铺展.

Fig.5 Dynamic impact process of droplet(water and escin solution of different concentrations)on PTFE hydrophobic surface(A-C),viscosity of escin solution with different concentrations(D)

为了更好地了解液滴与固体表面作用的全过程，分别量取液滴初始直径D0、铺展直径Dt、弹跳高度Hr，采用归一化铺展直径（Dt/D0）和归一化弹跳高度（Hr/D0）对时间t作图［图5（B）和（C）］，并计算了整个过程的撞击参数［液滴初始直径（D0）、最大铺展直径（Dmax）、回缩速率（Vret）、最终直径（Df）、最大回弹高度（Hmax）和回缩百分比（RP）］［28］（表1）.

从图5（B）和（C）及表1可以看出，不同液滴在疏水表面上发生撞击后均发生相似程度的铺展，之后发生回缩.水滴回缩速率（0.44 m/s）较大，且回缩百分比达到68%.向水中加入少量七叶皂素，浓度为1×10-4mol/L时，回缩速率（0.26 m/s）明显降低，但回缩百分比没有明显改善.随着七叶皂素浓度增大，液滴回缩明显减弱.浓度为1×10-3mol/L时，回缩速率低至0.08 m/s，且仅液滴的24%发生回缩，可以认为达到了很好的抑制回弹的效果.而考察弹跳情况时发现，水滴因完全弹起离开表面，所以Hmax/D0最高达到2.33.与之相比，七叶皂素加入后，明显抑制了液滴的弹起，且随着浓度增大，抑制作用明显增加.

Table 1 Impact parameters of different droplets on the PTFE hydrophobic surface

液滴在固体表面的弹跳行为由液体性质和固体表面性质共同决定，通常对于特定场景，固体表面性质多是固定不变的，因此主要通过改变液体的性质（黏度、表面张力）来调控液滴的弹跳行为［29，30］.为了考察七叶皂素抑制液滴回缩过程中，液体黏度是否起到一定作用，测定了水和不同浓度七叶皂素溶液的黏度.如图5（D）所示，所有样品的黏度随剪切速率的增加会先下降后达到平衡，不同样品的黏度结果相似，无明显差异.可见，与聚合物增加拉伸黏度不同，对于七叶皂素而言，抑制液滴在疏水表面上回缩的主要因素不是黏度，而是表面张力的差异［31］.液滴先在惯性力作用下发生相似程度的铺展，随后在各自表面张力作用的驱动下发生不同程度的回缩.纯水具有较高表面张力，因此快速发生明显回缩.相比之下，在纯水中加入表面活性剂七叶皂素之后，液滴铺展过程中，七叶皂素分子会迅速从体相迁移到新生成的固-液-气界面处，在界面处有效吸附（见Scheme 1），亲水糖基朝向液体内侧，疏水的三萜骨架环朝向外侧，降低表面张力，进而使得回缩速率显著减缓，回缩百分比显著减小.随着七叶皂素浓度升高，分子界面吸附量增多，表面张力减小幅度更大，这种抑制回缩的作用也更明显.可见，高浓度的七叶皂素可以有效抑制液滴撞击疏水表面后的弹跳、迸溅，并使之很好地润湿并铺展，在增加农药对靶沉积和提高剂量传递效率方面具有重要意义.

3 结 论

系统研究了天然产物七叶皂素的气-液、液-液（油-水）、液-固界面性质，分别探究了其表面张力、油-水界面张力，以及以七叶皂素为乳化剂所制备乳液的性质.在此基础上，还研究了其溶液在疏水表面撞击的动态过程及抑制弹跳和回缩的能力.研究发现，七叶皂素能在气-液界面发生吸附，显著降低水的表面张力，临界胶束浓度为5×10-4mol/L.同时，其对于降低油-水界面张力也有显著作用.以七叶皂素为乳化剂制备的农用油乳液，随浓度增大粒径逐渐降低，Zeta电势的绝对值逐渐增大，短时间内的稳定性显著提高.此外，高浓度的七叶皂素溶液可以很好地抑制液滴在疏水固体表面的弹跳，促进液滴铺展.研究结果对深入理解生物基表面活性剂的界面行为及拓展其应用具有重要的借鉴意义.