4859枚非优质胚胎和废弃胚胎囊胚培养的临床观察

曹晓敏 刘 丽 邸建永 刘 烨 徐凤琴

天津市第一中心医院(300192)

在不孕症患者的体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗周期中，仅有少数胚胎具有可利用价值，50%以上的胚胎因发育异常而被丢弃。如何从大量废弃胚胎和不够冷冻标准的胚胎中挑选出有发育潜能的胚胎，提高其利用率，仅见数篇小样本回顾性报道[1-4]。为探讨废弃胚胎和新鲜周期移植后不够冷冻标准胚胎的发育潜能及继续培养形成囊胚移植后的临床结局，本文收集废弃的和新鲜周期移植后不够冷冻标准的D3胚胎行囊胚培养的数据，分析囊胚形成情况，将形成的可利用囊胚冷冻保存，冻融周期与移植冻融D3的胚胎进行比较，分析其临床利用价值。

1 对象和方法

1.1 研究对象

收集本院2014年10月-2019年2月行IVF-ET及卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)周期废弃和部分非优质胚胎，按照表1的标准进行胚胎评分并行囊胚培养[5]。本研究经本院伦理委员会讨论批准，所有患者均签署“自愿将废弃胚胎用于科学研究的知情同意书”。

表1 卵裂期胚胎分级标准[5]

1.2 相关定义

①废弃胚胎：第3天(D3)Ⅲ+～Ⅳ级胚胎。②非优质胚胎：D3卵裂球数目≥10个或≤6个的Ⅰ～Ⅲ级胚胎。③卵裂期胚胎冷冻标准：D3卵裂球数7～9个，Ⅰ～Ⅱ+级胚胎，优质胚胎标准：D3卵裂球数7～9个，Ⅰ～Ⅱ级胚胎。④冷冻囊胚标准：第5天(D5)或第6天(D6)的3期以上，内细胞团或滋养层评分为B级以上的囊胚。⑤优质囊胚：D5或D6的3期以上，内细胞团和滋养层评分为B级或A级的囊胚。

1.3 培养方法

囊胚培养液(G2 plus,瑞典 Vitrolife 公司产品)在35mm的培养皿中制作30μl的微滴，覆盖矿物油，置于37℃、6% CO2培养箱中平衡过夜。将D3废弃的胚胎和移植后不够冷冻标准的胚胎在囊胚培养液中漂洗后，转移至新鲜的囊胚培养微滴中培养至D5～D6，观察记录胚胎的发育情况，囊胚的评分依据Gander分级法[6-7]。

1.4 囊胚的冷冻和复苏

囊胚的冷冻和复苏按照玻璃化冷冻试剂盒和玻璃化冻融试剂盒(KITAZATO,日本)说明书操作。冻融囊胚存活的标准为冻融培养2h观察到囊胚腔的扩张。

1.5 冻融胚胎移植

取卵周期移植未孕患者行冻融周期，复苏D3废弃和部分非优质胚胎未达到冷冻标准的胚胎继续培养形成的囊胚和D3可利用的胚胎(冷冻、复苏方法相同)进行移植，移植后28d，超声观察到胚芽及孕囊即为临床妊娠，记录孕囊个数、流产情况(超声观察到妊娠囊后到不满28周前妊娠结束)，持续妊娠者随访至分娩。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件包进行统计学分析。正态分布计量资料比较采用t检验；计数资料采用卡方检验或fisher确切概率检验。多组比较有统计学差异时进行组间两两比较，并采用Bonferroni方法进行多重检验校正。采用logistic回归进行多因素回归分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 囊胚形成情况

收集1195个取卵周期废弃的D3胚胎和移植术后不够冷冻标准的非优质胚胎共计4859枚，使用G2序贯微滴培养至D5～D6，共形成囊胚2020枚，总囊胚形成率41.6%(2020/4859)，优质囊胚形成率32.7%(661/2020)。其中培养废弃胚胎2345枚，囊胚形成率18.3%(430/2345)，优质囊胚形成率15.1%(65/430)。培养移植术后不够冷冻标准的非优质胚胎2514枚，囊胚形成率63.2%(1590/2514)优质囊胚形成率37.5%(596/1590)。本研究进行多组率比较时采用了Bonferroni多重检验校正，校正后的检验水准α’=0.05/6=0.0083。废弃胚胎的囊胚形成率和优质囊胚形成率均低于非优质胚胎组。不孕类型、受精方式不同患者优质囊胚形成率无统计学差异(P>0.05)。但囊胚形成率随患者年龄增加减低，年龄>35岁患者囊胚形成率明显减低(P<0.05)。见表2 。

表2 不同来源胚胎培养后囊胚和优质囊胚形成率比较

2.2 卵裂数及胚胎分级与囊胚形成情况

以是否形成囊胚作为应变量，以卵裂球数和胚胎分级为自变量做logistic回归分析，结果提示与卵裂球数≥10个相比，卵裂球数7～9个时形成囊胚的概率为0.893(95%CI 0.602～1.325)，而卵裂球数4～6个时，则为0.572(95%CI 0.393～0.831)。与Ⅰ～Ⅱ级胚胎相比，Ⅱ+～Ⅲ胚胎形成囊胚的概率为0.737(95%CI 0.578～0.941)，而Ⅲ+级胚胎为0.750(95%CI 0.456～1.235 )，而Ⅳ级胚胎为0.471(95%CI 0.350～0.634)。

2.3 卵裂球数和胚胎分级与优质囊胚形成情况

在2020个形成囊胚的胚胎中，以是否形成优质囊胚作为因变量，以卵裂球数和胚胎分级为自变量做logistic回归分析，结果提示与卵裂球数≥10个相比，7～9个时形成囊胚的概率为0.725(95%CI 0.598～0.896)，4～6个时为0.498(95%CI 0.396～0.628)。与Ⅰ～Ⅱ级胚胎相比，Ⅱ+～Ⅲ级胚胎形成囊胚的概率为0.442(95%CI 0.365～0.536)，Ⅲ+级胚胎为0.155(95%CI 0.070～0.344)，Ⅳ级胚胎为0.150(95%CI 0.074～0.304)。

2.4 集合培养胚胎的数目与囊胚形成情况

每个微滴培养胚胎数目不同囊胚形成率有统计学差异(P=0.023)。每个微滴培养1枚胚胎优质囊胚形成率16.3%，与每个微滴培养2、3、4、7个胚胎相比差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 集合培养不同胚胎数与囊胚和优质囊胚形成率比较(%)

2.5 移植情况

405个冻融周期移植中取卵周期移植未孕患者中行冻融D3可利用胚胎移植204个(D3胚胎组)，废弃的D3胚胎和不够冷冻标准的非优质胚胎形成的囊胚解冻移植201个(胚囊组)。两组患者年龄、不孕类型、内膜准备方案及子宫内膜的厚度差异无统计学意义(P>0.05)。D3胚胎移植数多于囊胚移植数(P<0.05)。D3优质胚胎移植数多于优质囊胚移植数(P<0.05)。D3胚胎与囊胚冻融移植周期妊娠率无统计学差异(P>0.05)。但D3胚胎着床率低于囊胚组(P=0.026)。两组的流产率、双胎率、单卵双胎率、出生婴儿体重及出生畸形率也均无统计学差异(P>0.05)。见表4。

表4 D3胚胎和囊胚冻融移植周期患者一般情况及临床结局比较

3 讨论

在不孕患者IVF-ET治疗周期中，绝大多数生殖中心选择D3胚胎移植或冷冻保存，根据目前人类辅助生殖技术胚胎培养室采用的定点形态学评分方法，卵裂期有>50%的胚胎因发育异常最终被废弃，如何从大量废弃胚胎和不够冷冻标准的胚胎中识别有发育潜能的胚胎，提高其利用率，尚需大量临床数据证实。

本研究分析本中心1195个取卵周期中废弃的4859枚D3胚胎和不够冷冻标准的非优质胚胎进行囊胚培养和移植的结果提示，患者的不孕类型和受精方式不影响优质囊胚的形成。患者年龄、胚胎分级、卵裂球数目和囊胚培养方法影响囊胚的形成。冻融移植周期解冻培养的囊胚和正常的D3胚胎临床结局没有差别。

目前囊胚培养方法多采用微滴法集合培养，即将发育速度相近的胚胎置于1个微滴进行培养，充分利用其自分泌和旁分泌因子相互促进发育[8]。本研究根据每个微滴培养胚胎数目不同分成7组，不同组囊胚形成率差异虽有统计学意义(P=0.023)。每个微滴培养1枚胚胎组优质囊胚形成率与每个微滴培养2、3、4、7枚胚胎组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，但与每个微滴培养5、6枚胚胎组相比差异无统计学意义。可能是由于每个患者用于培养的胚胎数目不定，无法严格的做到发育速度相近的胚胎共培养，质量差与质量佳胚胎混合培养可能掩盖了7组囊胚形成率的差异。文献报道[9-10]，集合培养更容易耗竭培养液中的营养，另外质量差的胚胎分泌的因子释放到培养液中对其他胚胎生长也会产生负面影响。本研究结果提示：集合培养除相互促进发育外，不排除质量差胚胎分泌物质对胚胎发育的阻碍作用。

本研究对患者年龄分组比较其囊胚形成情况，患者年龄<35岁各组囊胚形成率没有差异，35岁后囊胚形成率显著减低，36～40岁囊胚形成率34.7%，年龄>40岁的患者囊胚形成率仅有15.4%。与文献报道一致[11-12]。众所周知，随着年龄增加女性生育潜能降低，女性35岁后卵巢功能急剧衰退，卵子和胚胎质量下降，妊娠率降低，流产率增加，胚胎染色体异常发生风险增加，文献报道高龄女性非整倍体胚胎比例较年轻女性高5倍[13-15]。本研究>35岁患者囊胚形成率减低可能与胚胎质量较差有关。但本研究优质囊胚形成率各组没有明显差异，有悖现有论点，原因目前还不清楚，有待于积累更多的数据进一步分析。

胚胎分级和卵裂球数对囊胚形成的影响，本研究Ⅰ-Ⅱ级胚胎培养后囊胚和优质囊胚形成率最高，如果Ⅰ～Ⅱ胚胎培养后囊胚形成的概率为1，那么Ⅱ+～Ⅲ级胚胎囊胚形成概率为0.737，Ⅲ+和Ⅳ胚胎囊胚形成概率0.750和0.471。表明囊胚的形成与胚胎分级密切相关，Ⅰ～Ⅱ级胚胎更容易形成囊胚和优质囊胚。在不孕症患者的辅助生殖治疗过程中有少数患者因为胚胎质量差而放弃移植，本研究表明Ⅳ级胚胎有0.471的概率形成囊胚和0.150的概率形成优质囊胚，且目前已有Ⅳ级胚胎冻融周期妊娠的病例，因此废弃胚胎的囊胚培养可以最大限度的提高胚胎的利用率。研究发现，卵裂球数目≥7个的D3胚胎更容易发育成优质囊胚[16]。本研究也得出类似的结论，不同的是笔者培养的是废弃的D3胚胎和非优质胚胎，卵裂球数目≥10个的D3胚胎囊胚形成率和优质囊胚形成率最高，卵裂球数目7～9个次之，4～6个明显降低。因此可推测，为避免盲目大量培养造成不必要的工作量和培养箱的紧张，卵裂球数目≤4个的D3胚胎没有囊胚培养的必要。

本文比较了取卵周期移植未妊娠患者行冻融胚胎移植周期中复苏的D3胚胎和复苏囊胚的临床结局，结果在移植囊胚数和优质囊胚数明显少于D3胚胎的前提下，两组妊娠率、流产率、双胎率、单卵双胎率、出生婴儿男女比例、出生婴儿体重及出生畸形率均无明显差异；移植囊胚组的着床率高与移植D3胚胎组(P=0.026)。此数据显示出囊胚移植的优势。因此在IVF/ICSI周期中D3胚胎可利用数目充足的情况下，可考虑选择行囊胚培养，形成可利用囊胚冷冻保存，再择期解冻移植。

综上所述，本研究证实：①部分废弃的D3胚胎继续培养有形成优质囊胚的潜能。②不孕类型、受精方式不影响优质囊胚的形成。③集合培养有利于囊胚的形成，其中胚胎的质量而不是胚胎的数量影响囊胚和优质囊胚的形成。④D3胚胎级别越高、卵裂球数目越多越易形成囊胚。