丁苯酞减轻H2O2诱导的人脐静脉和脐动脉内皮细胞氧化损伤

杨晓丽，王 征，张艳茹，冀静静，王孟帅

(1.河北工程大学附属医院 神经内科，河北 邯郸 056002；2.邯郸市第一医院 重症医学科，河北 邯郸 056002；3.邯郸市第二医院 内分泌科，河北 邯郸 056001;4.邯郸市第二医院 神经内科，河北 邯郸 056001 )

内皮功能障碍在动脉粥样硬化的病理生理过程中起着关键作用[1-2]，其发生机制包括氧化应激[3]。动脉粥样硬化与卒中、心肌梗死及肾脏病变等多种疾病密切相关。因此研究如何保护内皮功能至关重要。在研究内皮功能时一般选用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)，人脐动脉内皮细胞(human umbilical artery endothelial cells,HUAECs)主要用于动脉粥样硬化的体外研究，但因HUAECs的培养难度较大，以往研究选用的较少。因内皮功能与动脉粥样硬化密切相关，因此同时选用两种内皮细胞研究内皮功能可使得到的结果更加可靠。

丁苯酞主要用于治疗急性缺血性卒中[4]，也可抑制神经元凋亡[5]。但丁苯酞是否具有内皮保护作用目前研究较少。本实验主要研究氧化应激对血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)造成的影响以及丁苯酞是否具有内皮保护作用及其作用机制，为保护内皮功能寻找新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)(上海吉凯基因细胞库)，人脐动脉内皮细胞(HUAECs)(北纳创联生物科技有限公司)。

1.1.2 主要试剂：DMEM培养基和10%胎牛血清(Gibco公司)；H2O2(河北健宁药业有限公司)；丁苯酞(石药集团恩必普药业)；MTT(Biosharp公司)；罗丹明123和Annexin V/PI凋亡细胞检测试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；Fura-4/AM(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：将HUVECs和HUAECs培养于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2培养箱中进行培养。

首先建立H2O2损伤模型和检测NBP对细胞的影响。将细胞分为对照组，不同剂量H2O2干预组及NBP组(剂量：5和10 μmol/L)。根据预实验结果H2O2剂量在50～200 μmol/L时对HUVECs没有明显损伤作用，但对HUAECs已显现出损伤作用，因此选用300、500、700和900 μmol/L的H2O2剂量与HUVECs共培养24 h，选用100、200、300和400 μmol/L的H2O2剂量与HUAECs共培养24 h，来选取IC50值。

建立H2O2损伤模型后，接下来的实验将细胞分为对照组，不同剂量H2O2干预组(HUVECs组H2O2剂量：700 μmol/L；HUAECs组H2O2剂量：300 μmol/L)及NBP处理组(剂量：5和10 μmol/L，在H2O2前2 h加入)。

1.2.2 MTT法检测细胞活力：两种细胞以5×104个/mL的浓度接种于96孔板上，每孔100 μL置于培养箱中孵育24 h。24 h后进行MTT检测，每孔加入20 μL MTT溶液，继续放入培养箱中孵育4 h，小心吸掉旧培养基后每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，摇床上摇10 min，溶解生成的蓝紫色结晶，用酶标仪检测490 nm波长的吸光度值。

1.2.3 罗丹明123检测线粒体膜电位：将细胞培养在6孔板中，按照试剂操作说明配制细胞后加入10 μmol/L罗丹明123，在37 ℃的环境中，30 min后应用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，然后立即进行流式分析，结果用Expo 32 ADC软件进行处理。

1.2.4 Annexin V/PI检测凋亡细胞：将细胞培养在6孔板中，按照试剂操作说明配制细胞后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，保持在黑暗环境中15 min，滤过后，用流式细胞仪分析细胞凋亡率，结果用Expo 32 ADC软件进行处理。

1.2.5 Fura-4/AM检测细胞内游离钙：将细胞培养在6孔板中，按照试剂操作说明配制细胞后加入5 mmol/L Fluo-4/AM，40 min后用流式细胞仪测量细胞内游离钙的变化，结果用Expo 32 ADC软件进行处理。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 丁苯酞对两种血管内皮细胞均无毒性作用

两种剂量的丁苯酞(5和10 μmol/L)对两种细胞存活率与对照组相比无差异(图1)。

图1 两种剂量的丁苯酞对HUVECs(A)和HUAECs(B)均无明显影响Fig 1 NBP had no effect on the cell viability of HUVECs (A)and HUAECs n=5)

2.2 H2O2刺激可导致两种血管内皮细胞的细胞活力下降

随着H2O2剂量逐渐升高，HUVECs(图2A)和HUAECs(图2B)的细胞活力逐渐下降。与对照组相比，H2O2剂量分别为700和300 μmol/L时细胞活力下降约50%(P<0.05)，因此选取700和300 μmol/L的H2O2剂量来建立HUVECs和HUAECs的氧化损伤模型。

*P<0.05 compared with control group图2 不同剂量的H2O2均可造成血管内皮细胞的细胞活力下降Fig 2 Cell viability of HUVECs (A)and HUAECs (B)were assessed after various dosages of H2O2 treatment, the injury of the cells induced by H2O2 was in a dosage-dependent manner n=5)

2.3 丁苯酞可改善H2O2导致的血管内皮细胞活力下降

两种剂量的丁苯酞(5和10 μmol/L)提前干预HUVECs(图3A)和HUAECs (图3B)2 h后，再分别与700和 300 μmol/L的H2O2共培养24 h。与H2O2组相比，提前加入任何一种剂量的丁苯酞细胞活力都明显升高(P<0.05)，并且丁苯酞剂量为10 μmol/L时效果更明显。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group图3 丁苯酞可改善H2O2导致的血管内皮细胞活力下降，高剂量的丁苯酞效果更明显Fig 3 NBP improved the decrease of cell viability in VECs induced by H2O2,and high dosage of NBP had better effect n=5)

2.4 丁苯酞可减轻H2O2介导的血管内皮细胞线粒体膜电位下降

由于高剂量的丁苯酞作用较明显，因此在接下来的实验当中，选用丁苯酞的剂量为10 μmol/L。与对照组相比，H2O2刺激可导致两种血管内皮细胞的线粒体膜电位下降(P<0.05)，然而提前加入丁苯酞可使细胞线粒体膜电位下降的程度明显减轻(P<0.05)(图4)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group图4 丁苯酞可减轻 H2O2介导的血管内皮细胞线粒体膜电位下降Fig 4 NBP reduced the decrease of mitochondrial membrane potential mediated by H2O2 in VECs n=3)

2.5 丁苯酞可抑制 H2O2介导的血管内皮细胞凋亡

与对照组相比，H2O2刺激两种血管内皮细胞均可引起明显的细胞凋亡(P<0.05)，而提前加入丁苯酞可明显抑制H2O2引起的细胞凋亡(P<0.05)(图5)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group图5 丁苯酞可抑制 H2O2导致的血管内皮细胞凋亡Fig 5 NBP inhibited the apoptosis of VECs induced by H2O2 n=3)

2.6 丁苯酞可减少H2O2介导的两种血管内皮细胞内钙超载

与对照组相比，H2O2刺激可引起两种血管内皮细胞内游离钙增多(P<0.05)，而提前加入丁苯酞可明显减少两种细胞内游离钙的生成，防止钙超载(P<0.05)(图6)。

A.HUVECs;B.HUAECs;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with H2O2 group图6 丁苯酞可减少 H2O2导致的血管内皮细胞内钙超载Fig 6 NBP reduced H2O2-induced calcium overload in VECs n=3)

3 讨论

内皮细胞是血管腔表面的单层细胞，起着物理屏障的作用，可合成和释放多种血管活性物质，在血管自稳态调节中起着重要作用。内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化的早期标志，因此保护内皮功能是预防动脉粥样硬化的关键步骤。活性氧(ROS)包括过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH-)等，在许多生理和病理生理事件中起着重要作用。过量的ROS是导致内皮功能障碍的主要原因[6-7]。过量的ROS可诱导线粒体双层膜通透孔开放，释放Ca2+和细胞色素C，进而引起促凋亡蛋白释放，最后使线粒体外膜破裂，导致细胞凋亡[8]。本研究发现H2O2对两种血管内皮细(HUVECs和HUAECs)均可导致明显损伤，细胞活力明显下降，细胞凋亡增加。

大量的研究报道了丁苯酞在改善急性缺血缺氧损伤方面的神经保护作用[9-10]，但丁苯酞是否具有内皮保护作用并不十分清楚。本研究证实了两种剂量的丁苯酞对H2O2诱导的两种血管内皮损伤均具有保护作用，高剂量的效果较明显，这与既往的研究结果相同[11]。丁苯酞可减轻H2O2对两种血管内皮细胞所造成的氧化损伤，抑制细胞凋亡，表明丁苯酞可通过抗氧化作用保护内皮细胞。

线粒体膜电位损伤是线粒体功能受损的标志，细胞内钙超载不仅可影响血管活性物质正常作用的发挥，还可以导致线粒体吸收钙增多，导致线粒体功能障碍[12]。丁苯酞可抑制H2O2介导的两种血管内皮细胞的线粒体膜电位下降及细胞内钙超载，表明丁苯酞可通过保护线粒体这一途径来保护内皮细胞。

综上所述，本研究证实了丁苯酞可减轻氧化应激介导的人脐静脉内皮细胞和脐动脉内皮细胞氧化损伤。丁苯酞可通过提高细胞活力，抑制细胞凋亡，防止细胞内钙超载，改善线粒体功能等途径保护内皮细胞，从而预防动脉粥样硬化的发生。本研究选用两种血管内皮细胞，使得到的结果更加全面和可靠，为临床应用保护内皮功能药物和抗动脉粥样硬化治疗开辟了新的选择方法。