miR-133a-3p靶向调控CD2AP基因减轻RSV感染的人支气管上皮细胞系16-HBE损伤

梁 敏，李 弯，熊诗思，边俊梅

(武汉大学附属同仁医院/武汉市第三医院 儿科，湖北 武汉 430074)

哮喘(asthma)是临床常见的一种呼吸系统疾病，中国哮喘发病率逐年上升，严重影响患者生活质量，研究表明支气管上皮细胞凋亡在哮喘发生过程中发挥重要作用，基于此探讨哮喘发病机制具有重要意义，其中呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起哮喘的重要原因之一[1-2]。微小RNA(miRNA)可参与人支气管上皮细胞炎性反应、凋亡、增殖等过程，并可为哮喘的治疗提供新方向[3-4]。微小RNA-133a-3p(miR-133a-3p)在瘢痕疙瘩成纤维细胞中呈低表达，上调其表达可抑制细胞增殖及纤维化[5]。但miR-133a-3p在哮喘发生过程中的作用机制尚未阐明。靶基因预测显示CD2相关蛋白(CD2-associated protein，CD2AP)与miR-133a-3p存在结合位点，CD2AP表达上调可促进足细胞凋亡从而增加糖尿病肾病的发生风险[6]。但miR-133a-3p是否可靶向调控CD2AP的表达从而参与哮喘发生过程尚未可知。因此，本研究采用RSV感染人支气管上皮细胞建立细胞损伤模型，探讨miR-133a-3p对RSV感染的支气管上皮细胞凋亡及炎性反应的影响，及其对CD2AP的靶向调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本：收集武汉市第三医院儿科2017年10月至2019年11月收治的59例支气管哮喘儿童的支气管黏膜组织标本为AsP组，其中男30例，女29例，年龄5～14岁，平均年龄(8.6±2.6)岁，同时选取59例支气管扩张非哮喘儿童的支气管黏膜组织标本为NC组，其中男39例、女20例，年龄6～15岁，平均年龄(8.8±3.2)岁。

1.1.2 细胞与主要试剂：呼吸道合胞病毒(RSV)(武汉中国科学院武汉病毒研究所)；人支气管上皮细胞系16-HBE(上海酶研生物科技有限公司)；Lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen 公司)；反转录试剂与RT-qPCR试剂(北京天根生化科技有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1α检测试剂盒(上海百蕊生物科技有限公司)；凋亡检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；兔抗人CD2AP 抗体(Abcam公司)；兔抗人cleaved-caspase-3抗体、HRP标记的山羊抗兔二抗(武汉艾美捷科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验的分组：采用TCID50法检测RSV病毒悬液的感染毒力(MOI=病毒数/感染细胞数)，其中MOI为0.000 1，待16-HBE细胞贴壁面积达到70%时弃培养基，加入不含胎牛血清的DMEM培养基洗涤后加入1 mL RSV病毒悬液(MOI值稀释后)，充分混匀后于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱继续孵育3 h，弃未吸附的病毒液，加入培养液继续培养2～3 d，细胞传代并将后代细胞作为持续感染RSV的16-HBE细胞[7]，并记为RSV组。同时将正常培养的细胞作为NC组。采用Lipofectamine2000试剂分别将miR-NC、miR-133a-3p mimics、si-NC、si-CD2AP、pcDNA-NC、pcDNA-CD2AP、miR-133a-3p mimics与pcDNA-NC、miR-133a-3p mimics与pcDNA-CD2AP转染至感染RSV的16-HBE细胞，分别记作miR-NC+RSV组、miR-133a-3p+RSV组、si-NC+RSV组、si-CD2AP+RSV组、pcDNA-NC+RSV组、pcDNA-CD2AP+RSV组、miR-133a-3p+pcDNA-NC+RSV组、miR-133a-3p+pcDNA-CD2AP+RSV组。

1.2.2 RT-qPCR检测细胞中miR-133a-3p、CD2AP mRNA表达水平：用Trizol法提取黏膜组织及16-HBE细胞中总RNA，反转录得到cDNA，按照RT-qPCR试剂盒说明书配置反应体系，应用罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测miR-133a-3p(内参U6)、CD2AP mRNA(内参β-actin)相对表达量。

1.2.3 ELISA检测炎性因子的水平：取16-HBE细胞培养上清液，用ELISA法检测TNF-α、IL-6、IL-1α的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 流式细胞术测量细胞凋亡率：16-HBE细胞加入预冷PBS洗涤，弃上清后加入500 μL结合缓冲液重悬细胞，按照试剂盒说明书分别添加annexin V-FITC与PI，充分混匀后于1 h内上机检测各组细胞凋亡率。

1.2.5 双荧光素酶报告基因检测miR-133a-3p与CD2AP的靶向关系：分别构建野生型载体WT-CD2AP与突变型载体MUT-CD2AP，分别将miR-NC、miR-133a-3p mimics与WT-CD2AP、MUT-CD2AP共转染至RSV感染的16-HBE细胞中，继续培养24 h后收集细胞并检测荧光素酶活性。

1.2.6 Western blot检测CD2AP、cleaved-caspase-3蛋白表达：提取细胞总蛋白，按照BCA检测试剂盒说明书检测蛋白浓度，采用SDS-PAGE分离蛋白，转膜、封闭，孵育一抗稀释液(1∶1 000)，孵育二抗稀释液(1∶2 000)，暗室内曝光显影后应用ImageJ软件分析各条带吸光度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 在哮喘患者支气管黏膜组织中miR-133a-3p和CD2AP的表达水平

与NC组比较，AsP组支气管黏膜组织中miR-133a-3p的表达水平降低(P<0.05)，CD2AP mRNA的表达水平升高(P<0.05)(表1)。

表1 在哮喘患者支气管黏膜组织中miR-133a-3p和CD2AP的表达水平Table 1 The expression levels of miR-133a-3p and CD2AP in bronchial mucosa of asthmatic

2.2 RSV感染16-HBE后miR-133a-3p和CD2AP表达水平

与NC组比较，RSV组miR-133a-3p的表达水平降低(P<0.05)，CD2AP mRNA及蛋白水平升高(P<0.05)(图1，表2)。

图1 Western blot检测CD2AP的蛋白表达量Fig 1 Western blot was used to detect the protein expression of CD2AP

表2 RSV对16-HBE中miR-133a-3p和CD2AP表达的影响Table 2 Effect of RSV on the expression of miR-133a-3p and CD2AP in

2.3 过表达miR-133a-3p对RSV感染的16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响

与NC组比较，RSV组TNF-α、IL-6、IL-1α的水平升高(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；与miR-NC+RSV组比较，miR-133a-3p+RSV组TNF-α、IL-6、IL-1α的水平降低(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)(图2，表3)。

表3 过表达miR-133a-3p对RSV感染的16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响Table 3 Effect of over-expression of miR-133a-3p on the apoptosis and secretion of asthma-related inflammatory factors in RSV-infected

2.4 低表达CD2AP对RSV感染的16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响

与si-NC+RSV组比较，si-CD2AP+RSV组TNF-α、IL-6、IL-1α的水平降低(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)(图3，表4)。

图3 Western blot检测CD2AP、cleaved-caspase-3表达Fig 3 Western blot was used to detect the expression of CD2AP and cleaved-caspase-3

2.5 miR-133a-3p靶向调控CD2AP蛋白表达

Starbase预测显示miR-133a-3p与CD2AP存在结合位点(图4A)。miR-133a-3p过表达可明显降低野生型载体WT-CD2AP的荧光素酶活性(P<0.05)(表4)。与miR-NC组比较，miR-133a-3p组CD2AP蛋白水平降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-133a-3p组CD2AP蛋白水平升高(P<0.05)(图4B，表5)。

A.flow cytometry was used to detect apoptosis;B.Western blot was used to detect the expression of cleaved-caspase-3 protein图2 过表达miR-133a-3p对RSV感染的16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响Fig 2 Effect of over-expression of miR-133a-3p on the apoptosis and secretion of asthma-related inflammatory factors in RSV-infected 16-HBE

表4 低表达CD2AP对RSV感染的16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响Table 4 Effect of low expression of CD2AP on the apoptosis of RSV-infected 16-HBE and the secretion of asthma-related

A.starbase predicts the combination of miR-133a-3p and CD2AP;B.Western blot was used to detect CD2AP protein expression图4 miR-133a-3p靶向调控CD2AP 表达Fig 4 miR-133a-3p targets and regulates CD2AP expression

表5 miR-NC或miR-133a-3p与报告质粒共转染16-HBE细胞后双荧光素酶活性检测Table 5 Detection of dual luciferase activity after co-trans fection of miR-NC or miR-133a-3p and reporter

2.6 高表达CD2AP可以逆转miR-133a-3p对RSV感染16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响

与pcDNA-NC+RSV组比较，pcDNA-CD2AP+RSV组TNF-α、IL-6、IL-1α的水平升高(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)；与miR-133a-3p+pcDNA-NC+RSV组比较，miR-133a-3p+pcDNA-CD2AP+RSV组TNF-α、IL-6、IL-1α的水平升高(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，cleaved-caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)(图5，表6～7)。

图5 Western blot检测CD2AP、cleaved-caspase-3表达Fig 5 Western blot was used to detect the expression of CD2AP and cleaved-caspase-3

表6 Western blot检测CD2AP蛋白的表达Table 6 Western blot was used to detect the expression

3 讨论

LncRNA MIAT/miR-133a-3p轴调节心房纤颤和心房纤颤诱发的心肌纤维化[8]。miR-133a-3p/MMP-9轴可影响动脉粥样硬化血管平滑肌细胞增殖[9]。过氧化氢诱导的心肌细胞中miR-133a-3p的表达水平降低，丹参酮IIA通过上调miR-133a-3p的表达而改善冠状动脉疾病[10]。本研究结果显示，哮喘患儿支气管黏膜组织及RSV感染的支气管上皮细胞中miR-133a-3p的表达水平降低，提示miR-133a-3p表达下调可能促进哮喘的发生。RSV感染的支气管上皮细胞中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1α的分泌量明显增多，并可激活正常T细胞表达及活化T细胞从而促进其他炎性因子的释放[11]。本研究结果显示，RSV感染的支气管上皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1α的水平升高，与上述研究结果相似，提示支气管上皮细胞损伤模型建立成功。本研究进一步分析显示，miR-133a-3p过表达可明显降低RSV感染的支气管上皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1α的水平，提示miR-133a-3p过表达可抑制RSV感染的支气管上皮细胞炎性反应。随着炎性反应的加重可进一步激活线粒体凋亡途径，进而激活caspase级联反应，caspase-3活化形成cleaved-caspase-3，最终诱导细胞凋亡[12]。本研究结果显示，RSV感染的支气管上皮细胞凋亡率及cleaved-caspase-3蛋白水平升高，而miR-133a-3p过表达可明显降低凋亡率及cleaved-caspase-3蛋白水平，提示miR-133a-3p过表达可抑制RSV感染的支气管上皮细胞炎性反应而抑制细胞凋亡从而减轻细胞损伤。

本研究证实miR-133a-3p可靶向结合CD2AP，并可负向调控CD2AP的表达。研究表明CD2AP在足细胞损伤中表达异常并可能参与糖尿病肾病、肾病综合征等疾病发生过程[13-15]。本研究结果显示，哮喘患儿支气管黏膜组织及RSV感染的支气管上皮细胞中CD2AP 的表达水平升高，抑制CD2AP表达可明显降低TNF-α、IL-6、IL-1α的水平及细胞凋亡率，提示抑制CD2AP表达可抑制RSV感染的支气管上皮细胞炎性反应及细胞凋亡从而减轻细胞损伤。同时本研究结果显示，miR-133a-3p过表达与CD2AP过表达联合处理后，RSV感染的支气管上皮细胞中TNF-α、IL-6、IL-1α的水平升高，并可提高细胞凋亡率，提示CD2AP过表达可明显逆转miR-133a-3p过表达对RSV感染的支气管上皮细胞炎性反应及凋亡的作用。

综上所述，RSV感染的支气管上皮细胞中miR-133a-3p的表达水平降低，而CD2AP的表达水平升高，miR-133a-3p过表达可通过下调CD2AP的表达而抑制RSV感染的支气管上皮细胞炎性反应及凋亡从而减轻细胞损伤，其可能参与哮喘发生及发展过程，还可能为进一步揭示哮喘发病机制奠定实验基础。

表7 高表达CD2AP可以逆转miR-133a-3p对RSV感染16-HBE凋亡和分泌哮喘相关炎性因子的影响Table 7 High expression of CD2AP could reverse the effect of miR-133a-3p on the apoptosis of RSV infected 16-HBE and secretion of asthma-related inflammatory