菠菜NHX家族基因鉴定及其响应盐胁迫的表达分析

李茹霞，顾寅钰，李萌，陈传杰，梁晓艳，李俊林，邢延富，张海洋，付娆

（1.山东省蚕业研究所，山东 烟台 264002；2.烟台市福山区农业农村局，山东 烟台 265500）

土壤盐渍化作为一个普遍的环境问题，已经成为制约农业生产力的世界性难题［1，2］。对于大部分植物来说，高盐胁迫的危害主要是由高浓度Na＋积累导致的。虽然不同植物的耐盐机制存在差异，但其基本策略都是保持胞内Na＋的平衡［3］。

离子和pH稳态在植物生长发育的细胞过程中起着重要的调节作用，离子运输在生物过程的许多方面起着至关重要的作用，如离子的吸收或隔离、提供能量和细胞的扩展。最佳离子和pH梯度取决于H＋转运酶和阳离子/H＋交换器［4］。在众多的单价阳离子/质子逆向转运（CPA1）家族中，Na＋/H＋逆向转运蛋白（NHX）为二次离子转运体，是离子转运体中的重要成员，在细胞的各个隔间中介导H＋与Na＋/K＋在膜上的交换转运［5］。根据已有研究，除了酵母只含有一个NHX基因外，所有已测序的真核生物都含有多个NHX家族成员，并被指定为Na＋/H＋交换器（NHEs）［6，7］。根据其家族成员的亚细胞定位，NHXs分为3类:定位于液泡膜上的（Vac－class）、定位于核内体膜上的（Endo－class）和定位于质膜上的（PMclass）［8］。在哺乳动物中，NHXs的特殊亚细胞功能依赖于其器官特异性的分布［9］。

在拟南芥中，NHX家族由6个细胞内基因（其中AtNHX1～AtNHX4属于Vac－class，At-NHX5、AtNHX6属于Endo－class）和2个质膜结合基因（AtNHX7、AtNHX8）组成［10］。根据生化和动力学分析，NHXs含有10～12个跨膜结构域，在功能上可能具有同源二聚体功能［9］。虽然At-NHX1在拓扑结构特征上与其他已知的NHXs逆向转运蛋白不同，但根据疏水性分析，它仍然含有10～12个跨膜结构域［11］。

NHXs基因参与多个生物过程，包括对外界盐胁迫的响应［10－12］，从植物体内pH稳态［12，13］、K＋稳态［14，15］、细胞扩张［16，17］、细胞囊泡的转运等多个方面影响植物的生长发育［4，9］。拟 南 芥nhx1nhx2双突变体幼苗与单突变体和野生型幼苗相比，生长速度明显降低；显微观察结果显示，nhx1nhx2双突变体各组织的细胞扩张均明显减弱，特别是在快速伸长的器官中，如花丝和黄化下胚轴［18］。另外，nhx1nhx2双突变体对外源K＋敏感，表现出根卷曲、叶片黄化膨大等表型［18，19］。Endo亚家族的AtNHX5和AtNHX6定位于跨高尔基体网络（TGN），在囊泡运输（尤其是在液泡运输中）起着关键的调节作用［7］。在盐胁迫下，细胞外高浓度的钠离子流入细胞，当Na＋积累到有害水平时，PM亚家族的AtNHX（AtNHX7/SOS1）会主动将Na＋排出细胞，而Vac亚家族的AtNHXs则介导Na＋进入液泡，将Na＋隔离于液泡中［14］。

菠菜是重要的绿叶蔬菜之一，具有较高的经济价值。菠菜基因组测序的完成和遗传转化体系的建立［20－22］，使得菠菜重要基因的功能研究成为可能。NHXs在菠菜体内的功能尤其是在维持Na＋平衡方面目前还没有详细研究报道。前期，我们通过生物信息学方法，从菠菜中鉴定出6个NHX家族基因，并进行系统进化树分析及不同亚家族的基因结构与蛋白保守结构域分析，结果与拟南芥相似，但整个家族的基因数目少于拟南芥，该家族基因的生物学功能还未明确。为了探究菠菜NHXs在功能上的差异，本研究对其进行了系统的生物信息学分析，可为进一步研究菠菜NHXs基因的进化和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菠菜品种为保存的山东小叶菠菜品种，2020年9月播种于山东省蚕业研究所植物光照培养箱中，待幼苗四叶一心时，分别置于正常条件及200 mmol/L NaCl胁迫条件下进行处理，重复3次。处理0、3、6、12 h后选取幼嫩植株作为样品，经液氮速冻后，置－80℃保存备用。

1.2 菠菜NHX家族相关生物信息学分析及进化树构建

以已知的8个拟南芥NHX蛋白（TAIR，https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp）对菠菜基因组（SpinachBase，http://www.spinachbase.org/）进行Blast，并通过SMART（http://smart.embl－heidelberg.de/）和Pfam工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）鉴定菠菜NHX基因。使用Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2）进一步预测其跨膜结构域数量。运用在线软件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）绘制基因结构图；运用Protparam（https://web.expasy.org/protparam/）在线网站进行氨基酸数、分子质量、理论等电点等预测；采用MEME（http://meme－suite.org/tools/meme）进行蛋白motif保守基序分析。通过TAIR与Phytozomev 12.1下载拟南芥（At）、水稻（Os）蛋白序列，使用MEGA 7.0软件采用邻接法（neighbor－joining，NJ）构建系统进化树，进化标准Bootstrap值设置为1 000。

1.3 总RNA的提取、引物设计和qRT－PCR分析

从菠菜基因组数据库中下载SpoNHX基因家族的CDS序列，利用Primer Premier 5.0进行荧光定量PCR引物设计（表1），引物由华大生物工程股份有限公司（青岛）合成。采用Trizol法提取总RNA，采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000检测RNA质量以确保总RNA的完整性和浓度。参照TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反转录试剂盒说明书进行cDNA第一链合成，置于－20℃保存备用。qRT－PCR扩增选用荧光定量专用试剂TransStartⓇTop Green qPCR SuperMix（＋DyeⅡ）（北京全式金生物技术有限公司）。反应体系（20 μL）:2×qPCR SuperMix 10μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，cDNA 1μL，ddH2O 7μL。反应程序:95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，44个循环；扩增完全后温度从65℃缓慢上升至95℃进行熔解曲线绘制，上升速度为每0.05 s上升0.5℃。每次循环第3步进行荧光采集，每个样品重复3次，利用2－△△Ct法进行数据分析，并使用SigmaPlot12.5绘制柱状图。

表1 菠菜NHX家族荧光定量PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 SpoNHX家族基因的鉴定和理化性质分析

通过将拟南芥中的NHX家族基因对菠菜基因组数据库进行同源序列比对，并经保守结构域等分析，我们从菠菜中筛选到6个NHX家族基因，根据SpoNHX基因与AtNHX基因的亲缘关系将其命名为SpoNHX1～SpoNHX6，其蛋白长度、等电点和相对分子质量等见表2。其中，ORF长度在236～1 162个氨基酸残基之间，等电点在4.64～9.11之间。

表2 SpoNHX家族基因信息及理化性质

2.2 SpoNHXs的系统进化关系及跨膜结构预测

将拟南芥、水稻和菠菜的NHX氨基酸序列进行比对，并用MEGA 7.0进行系统发育进化树的构建。结果表明，系统发育进化树将3个物种的NHX蛋白聚类为3个亚家族（Vac、Endo和PM），Vac亚家族包含3个SpoNHXs、4个AtNHXs以及4个OsNHXs；Endo亚家族包含1个SpoNHX、2个AtNHXs以及2个OsNHXs；PM亚家族包含2个SpoNHXs、2个AtNHXs以及1个OsNHX（图1）。该结果与其亚细胞定位结果相吻合。

图1 菠菜、拟南芥、水稻的NHXs进化树

利用Phyre2在线网站对鉴定出的SpoNHXs蛋白进行跨膜结构预测，结果表明，SpoNHX1～SpoNHX5含有13个跨膜结构域，而SpoNHX6只有6个跨膜结构域（图2）。

图2 SpoNHX家族蛋白的跨膜结构域

2.3 SpoNHX家族基因结构、蛋白的保守基序

对SpoNHX家族成员进行结构分析，结果表明6个SpoNHXs基因结构完整。SpoNHX1和SpoNHX2含有14个外显子，SpoNHX3含有13个外显子，SpoNHX4含有20个外显子，SpoNHX5含有23个外显子，SpoNHX6含有6个外显子（图3）。

图3 SpoNHX家族基因结构

利用MEME软件搜索并对SpoNHXs氨基酸序列进行保守基序分析，保守基序上限设置为15且允许序列中同一基序重复出现，结果（图4）表明，SpoNHX与AtNHX不同亚家族保守基序基本一致，说明NHX成员间保守性较高；其中，Vac亚家族中的SpoNHX1和SpoNHX2含有11个保守基序，而SpoNHX3含有9个保守基序；Endo亚家族中的SpoNHX4含有8个保守基序；PM亚家族中的SpoNHX5含有9个保守基序，SpoNHX6含有3个保守基序。

图4 SpoNHX家族蛋白基序分配

2.4 SpoNHXs基因盐胁迫下的表达分析

为探索SpoNHXs对盐胁迫的响应，采用qRTPCR检测该家族基因受盐胁迫0、3、6、12 h的表达情况，结果（图5）发现，盐胁迫后6个SpoNHXs基因均上调表达。其中SpoNHX1和SpoNHX6在盐胁迫下表达呈现先升高后降低的趋势，在6 h时表达最高，与对照相比差异显著；而SpoNHX2～SpoNHX5在盐胁迫下呈现一直上升的趋势，与对照相比差异不显著。

图5 盐胁迫下SpoNHX家族基因表达情况

3 结论

随着基因组测序和生物信息学研究的不断深入，越来越多物种中的NHX家族基因被鉴定出来并得到系统分析。本研究从菠菜中鉴定出6个NHX基因，分属于Vac、Endo、PM亚家族，其中，SpoNHX1、SpoNHX2、SpoNHX3属于Vac亚家族，SpoNHX4属于Endo亚家族，SpoNHX5和SpoNHX6属于PM亚家族。系统进化分析显示，SpoNHXs与拟南芥NHXs在进化距离上较水稻NHXs更近，这可能与菠菜和拟南芥同属于双子叶植物而水稻属于单子叶植物有关。SpoNHX1～SpoNHX5均含有13个跨膜结构域，SpoNHX6含有6个跨膜结构域。菠菜和拟南芥NHXs在不同亚家族中保守结构域高度一致，说明其可能具有相似的生物学功能。在盐胁迫条件下，SpoNHXs均上调表达，其中SpoNHX1和SpoNHX6表达水平呈现先升高后降低的趋势，且在胁迫处理6 h时显著高于对照，说明这两个基因在响应盐胁迫中发挥着较为重要的作用。本研究结果为菠菜NHX家族基因的克隆及功能预测提供了一定的理论参考，并为菠菜耐盐功能基因的深入研究奠定了理论基础。