除虫菊茎腐病原菌的分离和鉴定

袁丁

除虫菊茎腐病造成植株由茎基部开始向上变褐、腐烂，后期发展到花叶，整株枯死。本文采用柯赫氏法则，结合菌落、孢子形态等显微特征及ITS序列比对分析，首次证明除虫菊茎腐病主要由禾生镰孢菌直接侵染引起，尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌亦可从伤口侵入致病。

除虫菊是一种古老的天然杀虫菊科植物。它含有高效杀虫而对人畜无害的活性成分，如其中除虫菊素广泛用于生产杀虫剂和蚊香。随着规模化种植面积扩大和连年种植，病害日益突出，如除虫菊茎腐病危害严重，部分田块几近绝产，已成为除虫菊产业发展的瓶颈。初期，植株茎基部褐色至黑色腐烂，后期，部分侧枝甚至整株茎、叶、花全部黑褐色腐烂枯死。由于种植范围不广，除虫菊病害还未得到广泛关注，许多病原尚不清楚。本文从除虫菊茎腐病发病部位分离和鉴定了病原，旨在为制订该病防治策略提供理论依据。

1材料与方法

1.1病原菌分离

除虫菊茎腐病样本来自云南省峨山县双江镇福泉村。病原菌的分离采用常规组织分离法。从病株上剪下病健交界处，冲洗干净，切取1～2mm×1～2mm的组织，用70%酒精消毒30秒，再用0.1%浓度的升汞溶液消毒1～5分钟，然后用无菌水冲洗3次，每次1～2分钟，最后移植于PDA培养基平板上，置于25℃恒温条件下培养。待长出菌丝后，在菌落边缘用无菌接种针挑取菌丝块移至PDA培养基中，继续放入25℃恒温5d，再置于4℃冰箱内贮存备用。

1.2病原菌纯化

使用稀释法纯化病原菌。将初步纯化的病原菌转移至CLA（康乃馨叶片煎汁培养基）和SNA（Spezieller N？hrstof-farmer Agar）培养基上，25℃、12小时光照黑暗交替培养，期间保持病原菌氧气充足，5-15天后，显微镜下观察其产孢情况。挑取已产孢的菌落，加入1-2mL灭菌水后，用灭菌牛角匙刮取孢子于灭菌水中，吸取孢子悬浮液分级稀释，并各吸取1mL均匀涂在加入氯霉素的PDA培养基上，25℃培养48小時。挑取单菌落菌株培养。

1.3致病菌筛选

除虫菊采用漂浮育苗法培养，发芽后移栽至沙土基质中，按照柯赫氏法则，将纯化后的真菌用牙签接种法插入除虫菊幼苗基部，或菌株培养物土壤接菌的方法接菌，将培养4天，长满菌丝的较薄PDA培养基与灭菌基质混匀，以无菌PDA培养基与基质混匀做对照，覆盖除虫菊种子育苗，待幼苗长出后即可观察发病情况。植株发病后，从植株发病部位重新分离病原菌，最终筛选出致病真菌。

1.4菌株形态鉴定

1.4.1菌落形态观察

挑取纯化后的菌丝，移至直径10cm培养皿的PDA培养基中央，25℃、12小时荧光/12小时黑暗培养96小时后，测量菌落直径，并利用色谱卡观察比较培养基色泽，重复10皿。25℃下继续培养15天，观察是否有菌核产生。

1.4.2分生孢子形态特征观察

将纯化后的菌株转移至CLA或SNA培养基上，25℃、12小时荧光/12小时黑暗培养4-15天后，挑取菌丝，用无菌水制片，观察其产生的分生孢子类型，记录30个大型和小型分生孢子的形态、大小、隔膜数、有无足细胞。为了观察和计算菌丝及孢子，加酸性品红于10%氢氧化铵溶液中制片，盖玻片用两层指甲油涂抹封边。

1.5 rDNA ITS序列扩增与测序

采用何月秋的CTAB法[5]提取镰孢菌株的DNA，以真菌通用引物ITSI （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC 31进行rDNA ITS序列PCR扩增。扩增程序为：94℃预变性10 min；94℃变性1 min；55℃退火1min；72℃延伸2min；共25个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后送深圳华大基因研究院纯化测序。

1.6菌种的鉴定

将测序得到的DNA序列与NCBI数据库比对的同时，用DNAman、EditSeq等软件对DNA序列比对分析，并用MEGA等分析软件，以Maximum Likelihood法（1000 repeti-tions）构建分子系统树，并结合形态特征，参照Booth形态学分类系统进行种的鉴定。

2结果与分析

2.1除虫菊茎腐病症状

除虫菊茎腐病一般从茎基部、根部开始腐烂，幼苗可见茎基部叶片黑色或褐色腐烂，后期部分侧枝甚至整株茎、叶、花全部黑褐色腐烂枯死，最终导致整株死亡，影响十分严重。

2.2致病镰孢菌的形态鉴定

从供试病株中分离到4种镰孢菌：禾生镰孢菌、莲生尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌致病，且以禾生镰孢菌为主，它可通过菌培养物土壤接菌法直接致使除虫菊发病，而其他3种镰孢菌可通过伤口侵染。

2.2.1禾生镰孢菌（F.cerealis）的形态（编号D41）在PDA平板上培养96h后，菌落平均直径4.45cm，其边缘稍不规则，菌丝白色絮状，菌落中央呈橘黄色或棕黄色，外缘白色，后期菌落棕色。未见大型分生孢子，小型分生孢子棍棒状，大多有两个隔膜，大小为（7.7-15.3）μm×（2.3-3.5）μm。产孢细胞以芽生的方式产生分生孢子。

2.2.2莲生尖孢镰孢菌（F.oxyspomm f.sp.nelumbicola）（编号D47）在PDA平板上培养96h后，菌落平均直径6.05cm。菌丝白色絮状，由于大量分生孢子生成而呈粉质。小型分生孢子卵形。肾型或椭圆形，通常没有隔膜，极少数有1个隔膜，大小为（5-10）μm×（2-5）μm。大型分生孢子在CLA培养基上大量产生，在SNA培养基上也会生成。大型分生孢子镰刀形，少许弯曲，多数为3隔，大小为（18.8-48.9）μm×（2.4-4.6）μm。

2.2.3禾谷镰孢菌（F.graminearum）（编号D49）在PDA培养基上96h后，菌落平均直径大于9cm。菌丝白色，菌落呈玫瑰红色。实验室培养条件下未见小型分生孢子，大型分生孢子呈镰刀形，有隔膜2-7个，顶端钝圆，基部有明显足细胞。大小为（2.8-6.2）μm×（38.7-64.3）μm。endprint

2.2.4厚垣镰孢菌（F.chlamydospomm）（编号D50）在PDA平板上培养96h后，菌落平均直径5.48cm。菌落边缘整齐，菌丝白色稠密，菌落浅粉红色，中央颜色较深，后期菌落颜色变为棕黄色。未见小型分生孢子，大型分生孢子月牙形短粗壮，有隔膜2-3个，基部无足细胞，大小为（2.8-5.3）μm×（15.8-21.2）1xm。

2.3致病菌株ITS序列的测定与亲缘关系树的构建

分离纯化的菌株ITS序列与NCBI数据库比较的结果：分离的禾生镰孢菌、莲生尖孢镰孢菌同源性为99%，禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌同源性为100%。依据ITS序列与已知菌序列构建亲缘关系树状图可知：D41与禾生镰孢菌亲缘关系较近，为一类镰孢菌，其与其他类型的镰孢菌亲缘关系较远；D47、D49及D50分别于莲生尖孢镰孢菌、禾谷镰孢菌、厚垣镰孢菌亲缘关系较近，分属于相应的镰孢菌，其结果与同源比对结果相同。

3讨论

除虫菊在最初引入玉溪市范围内种植时，病害很少。随着种植年限的增加，病害越来越重，其中以茎腐病导致产量损失尤其突出。本研究结合形态学和ITS序列比对分析，鉴定出了4种镰孢菌与该病害有关，其中Fusaritma cerealis以培养物土壤接种，便可引起田间相同的症状，具有很强的侵染能力；Fusarium oxysporum f. sp.nelumbicola，F.graminearum，F.chlamydosporum只是在有伤口时才引起发病，侵染能力较弱。然而，在自然条件下，这后三者是否与前者复合侵染，且是否加重病害，还有待继续研究。

禾生镰孢菌多分离自小麦、大麦的根部和谷粒，也可在蓟等植物上分离到，但其引起的病害报道较少，本文第一次报道其能侵染除虫菊，引起茎腐病。莲生尖孢镰孢菌常被认为存在于水中及沙质土壤中，引起莲藕腐败病，未见到侵染除虫菊的报道，这可能与除虫菊种植范围不广，受关注的程度不够有关。实际上除虫菊亦在沙质土壤上生长较好，它侵染除虫菊引起茎腐病还是有可能的。禾谷镰孢菌能侵染小麦引起赤霉病，侵染玉米引起穗腐病，是禾谷类常见的一类病原菌。厚垣镰孢菌可引起瓜类、茄科、苹果、香蕉、棉、豆科及花卉等植物病害，是常见的土传病原真菌。这两种镰孢菌還未见到其侵染除虫菊的报道。然而，镰孢菌常存在专化型，即同种镰孢菌在不同植物上致病性存在很大差异，这些侵入除虫菊的镰孢菌是否为除虫菊致病专化型，还有待进一步试验证实。

真菌的ITS序列常作为分类的一种辅助手段，但正确分类还要与形态特征等性状相结合。本研究的D47和D49两菌株的形态特征相差很大，前者产生镰刀形大孢子和卵圆形小孢子，菌落白色絮状、粉质，后者仅产生大型分生孢子，菌落呈玫瑰红色，中央有黄色菌丝圈。两者ITS序列分别与F.oxysporum f.sp.nelumbicola和F.graminearum同源性分别为99%和100%，但聚类分析时，D47与D49亲缘关系比较相近，难以区分。本研究依据孢子形态、菌落特征，参考ITS序列信息，D47和D49分别被鉴定为F.oxysporumf.sp.nelumbicola和F.gramineamm。endprint