胃癌组织中RASGRF1基因甲基化及蛋白表达与其临床意义

唐维平，林珺珺，李启信

胃癌是临床常见的消化道恶性肿瘤，近年来其发病率逐年上升，并逐渐呈年轻化趋势，其发生情况与自身不良生活习惯密切相关[1]。由于该疾病发病隐匿，发病早期诊断较困难，病人在初次就诊治疗时大部分已发展至中晚期，即使手术后也易出现转移和复发，5年生存率较低[2]。目前临床对胃癌发病的分子机制尚未十分明确。Ras超家族是小分子GTP结合蛋白，通过介导多种细胞信号通路，而调控细胞的生物学过程。相关研究[3]发现，Ras超家族的多数成员是癌基因，具有促进癌细胞生长、增殖等作用，其蛋白异常表达或基因突变可诱发肿瘤。Ras蛋白特异性鸟苷酸释放因子1(RASGRF1)是能调控 Ras蛋白表达的信号分子，可作为星形细胞瘤的治疗靶点。甲基化作为表观遗传学的重要研究内容，其基因的甲基化是临床用以评价恶性肿瘤发生、发展的重要标志物[4]。相关研究[5]证实，RASGRF1蛋白表达及其基因甲基化与恶性肿瘤、衰老、老年痴呆等多种疾病的发生密切相关。本研究旨在探讨胃癌组织中RASGRF1基因甲基化及蛋白表达情况，并分析其临床意义。现作报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2017年1月至2019年1月于我院就诊的80例胃癌病人资料；年龄50～75岁；男46例，女34例；肿瘤直径≤3 cm 44例，>3 cm 36例；肿瘤分期依据2002年国际癌症联盟制订的胃癌TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期39例、Ⅲ～Ⅳ期41例；高中分化39例，低分化41例；远处转移54例，未远处转移26例。纳入标准：(1)经组织病理学检查确诊为胃癌；(2)均首次确诊；(3)入组前未行放化疗等相关治疗者；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤或严重内科疾病(如高血压、糖尿病、冠心病等)；(2)患有癌症家族史；(3)合并影响免疫组织化学或甲基化特异性检查结果的相关疾病；(4)胃癌组织边界不清，且难以取得相应癌旁组织者。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测RASGRF1蛋白表达情况 取手术切除的胃癌组织及相应的癌旁组织(距胃癌组织边缘>5 cm左右处)予以石蜡包埋，并连续切片。切片经65 ℃烤片3 h，依次采用二甲苯脱、梯度乙醇脱蜡、脱水。抗原修复液煮沸后修复抗原，等待自然冷却至常温。PBS冲洗3次(5 min)，3%H2O2避光孵育10 min消除酶活性；PBS冲洗3次(5 min)，羊血封闭10 min，加入RASGRF1一抗，于4 ℃孵育过夜。第2天，PBS冲洗3次(5 min)，加入二抗，于常温状态下下孵育30 min；PBS冲洗3次(5 min)后，依次采用DAB、苏木精、梯度乙醇、二甲苯、中性树胶予以显色、复染、脱水、透明、封片。由2位高年资的病理科医生依据双盲法阅片。根据细胞的染色强度分为：0分，无着色，表示染色阴性，阳性细胞比例≤5%；1分，浅黄色，表示弱染色，阳性细胞比例>5%～<33%；2分，棕黄色，表示中度染色，阳性细胞比例33%～66%；3分，棕褐色，表示强染色，阳性细胞比例>66%。根据获得的染色强度评分和阳性细胞比例，将2个值相乘判断RASGRF1蛋白表达，≤2分为阴性，>2分为阳性。

1.2.2 MSP法检测RASGRF1基因甲基化表达情况 于手术切除的胃癌组织及相应的癌旁组织提取组织DNA，经核酸蛋白分析仪鉴定可用于后续实验。取组织DNA 2 μg稀释至50 μL，与氢氧化钠溶液混匀，37 ℃水浴状态下静置30 min；加入氢醌30 μL混匀，再加入亚硫酸氢钠520 μL混匀后于-20 ℃状态下保存备用。引物均由上海铭博生物科技有限公司设计合成。反应条件95 ℃预变性15 min，95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环后72 ℃延伸3 min。取PCR扩增产物依据凝胶成像仪于紫外线下拍照分析。结果判定标准：甲基化，出现甲基化条带伴伴不伴非甲基化条带扩增；非甲基化，未出现甲基化条带扩增，仅出现非甲基化条带扩增。

1.3 统计学方法 采用χ2检验和Spearman相关分析。

2 结果

2.1 胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化情况比较 胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化表达情况差异均有统计学意义(P<0.01)(见表1)。Spearman相关分析结果显示，胃癌组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化呈负相关关系(r=-0.678，P<0.01)。

表1 胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化表达情况比较[n;百分率(%)]

2.2 胃癌组织中RASGRF1蛋白表达及基因甲基化与临床病理特征的关系 胃癌组织中RASGRF1蛋白表达与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化程度、发生远处转移无关(P>0.05)，与肿瘤分期有关(P<0.05)；胃癌组织中RASGRF1基因甲基化与性别、年龄、肿瘤直径、组织学分化程度无关(P>0.05)，与肿瘤分期、发生远处转移有关(P<0.05和P<0.01)(见表2)。

表2 RASGRF1蛋白表达及基因甲基化与临床病理特征的关系(n)

3 讨论

肿瘤的发生及发展是多因素改变及多基因变化的一个复杂过程，多种外源性致癌物的刺激、癌症基因的激活以及抑癌症基因的失活等基因改变与发生肿瘤密切相关[6-7]。亦有研究[8]证实，抑癌基因启动子甲基化是常见的表观遗传学改变，在肿瘤的发生和演变中发挥积极作用。此外，甲基化机制作为发病机制的早期时间，利用此机制对肿瘤的诊断具有重要意义。

RASGRF1基因是定位于人染色体25q15，长6 313 bp的Ras蛋白激活因子，也是目前临床研究较多的抑癌基因之一。目前，已检测到RASGRF1基因在多种恶性肿瘤中频繁甲基化。相关研究发现RASGRF1基因不仅与癫痫发作、脑外伤导致昏迷等多种神经系统疾病有关，还与多种恶性肿瘤的发生及发展密切相关[9]。钱伟明等[10]研究发现，RASGRF1基因甲基化阳性表达可增加患结肠癌的风险。本研究结果显示，胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1基因甲基化表达情况存在差异，胃癌组织中阳性表达率较高，胃癌组织中RASGRF1基因甲基化与肿瘤分期、发生远处转移有关，提示RASGRF1基因甲基化阳性在胃癌组织中高表达，其高表达与肿瘤分期、发生远处转移存在紧密联系。RASGRF1作为父亲印记基因，其编码RASGRF1蛋白能促进Ras 蛋白解离，并与GTP结合蛋白，从而激活Ras信号通路。相关研究[11]证实，RASGRF1蛋白可经DHPH2介导参与多种细胞的生物学过程。由于神经系统中RASGRF1蛋白表达较高，既往有关该蛋白的临床研究多集中于神经系统疾病。但近年来研究[12]发现，RASGRF1在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。有研究[13]发现，RASGRF1蛋白可通过抑制Ras蛋白，影响肿瘤的增殖、侵袭和转移。本研究结果显示，胃癌组织和相应癌旁组织中RASGRF1蛋白表达情况存在差异，胃癌组织中阳性表达率较低，该结果与既往研究[14]结果相似。此外，胃癌组织中RASGRF1蛋白表达与肿瘤分期有关，与发生远处转移无关，可能因本研究样本量较少，有待进一步扩大样本量进行分析。总之，本研究发现胃癌组织中RASGRF1蛋白表达与基因甲基化呈负相关性，该结果提示胃癌组织中RASGRF1蛋白表达的降低可能是RASGRF1基因甲基化升高的重要原因之一，推测RASGRF1基因甲基化抑制其蛋白的表达[15]。